肝素非还原端饱和结构的紫外吸收研究及在肝素寡糖测序中的应用

doi:10.7503/cjcu20200671

摘要/Abstract

摘要：

为了进一步探讨非还原端饱和结构的肝素寡糖在UV 232 nm的吸收情况, 制备了4种饱和结构的肝素二糖, 并用离子对反相液相色谱/离子阱飞行时间质谱(RPIP-LC/MS-IT-TOF)光电二极管阵列检测器分析了它们在UV 232 nm的吸收情况. 分析结果表明, 饱和结构的肝素二糖在UV 232 nm的检出限为9 μg(S/N=10), UV 232 nm/UV 206 nm约为不饱和结构肝素二糖UV 232 nm的7%~40%. 结果还表明, 肝素二糖UV 232 nm的吸收强度受亚硫酸基团(SO₃^2?)影响较大. 另外, 通过比较不饱和结构的肝素/硫酸类肝素(Hep/HS)标样二糖发现, 含N-未取代葡萄糖胺(GlcNH₃⁺)基团的二糖在UV 232 nm的吸收值较低. 最后, 通过简单的UV检测方法, 结合 HNO₂(pH=4.0)裂解法和RPIP-LC/MS-IT-TOF分析, 简化了含GlcNH₃⁺肝素六糖的测序方法. 本研究为以后用 HNO₂(pH=1.5)裂解法对混合组分N-硫酸化的肝素寡糖结构序列分析提供了可能.

关键词: 肝素, 饱和结构, 紫外吸收, 质谱, 测序

Abstract:

It is well known that the saturated structure in the non-reducing end（NRE） of heparin/heparan sulfate（HS） oligosaccharides is lacking ultraviolet（UV） 232 nm absorbance（normally used for specific detection of C4―C5 unsaturated oligosaccharides）， which poses a significant challenge for structure analysis. However， we found that saturated heparin oligosaccharides can be detected at UV 232 nm with sufficient sensitivity in our previous research. In order to further study the UV 232 nm absorbance of the saturated structure， four saturated heparin disaccharides were prepared， and then their UV 232 nm absorptions were analyzed by ion-pair reversed-phase liquid chromatography ion-trap/time-of-flight mass spectrometry（RPIP-LC/MS-IT-TOF） with photodiode array detector. The results show that the saturated heparin disaccharides can be detected with sufficient sensitivity by absorbance at UV 232 nm， which still with 7%―40% of UV 232 nm intensity of heparin unsaturated disaccharides. It seems that the UV 232 nm intensity might be affected by the sulfate groups in the disaccharides. In addition， comparing to the common unsaturated heparin/HS disaccharides as references， the disaccharides with GlcNH₃⁺ residues also showed less sensitivity at UV 232 nm. Finally， we simplified the sequencing method of the N-unsubstituted dp6 oligosaccharides by a simple UV detection method， combined with pH 4.0 HNO₂ scission and RPIP-LC/MS-IT-TOF analysis. This strategy offers possibilities for sequencing at N-sulfated residues using alternative pH 1.5 HNO₂ scission.

Key words: Heparin, Saturated structure, Ultraviolet absorption, Mass spectrometry, Sequencing

中图分类号:

O657

TrendMD:

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图/表 6

Table 1 Structures of the 12 unsaturated heparin disaccharides and the 4 heparin disaccharides with a saturated structure at the non-reducing end

	R¹	R²	Calc. m/z
ΔHexA?GlcNH₃⁺	H	H	337.0633
ΔHexA?GlcNH₃⁺(6S)	H	SO₃^-	417.0583
ΔHexA(2S)?GlcNH₃⁺	SO₃^-	H	417.0583
ΔHexA(2S)?GlcNH₃⁺(6S)	SO₃^-	SO₃^-	497.0151
ΔHexA?GlcNAc	H	H	379.1120
ΔHexA?GlcNAc(6S)	H	SO₃^-	459.0688
ΔHexA(2S)?GlcNAc	SO₃^-	H	459.0688
ΔHexA(2S)?GlcNAc(6S)	SO₃^-	SO₃^-	539.0256
ΔHexA?GlcNS	H	H	417.0583
ΔHexA?GlcNS(6S)	H	SO₃^-	497.0151
ΔHexA(2S)?GlcNS	SO₃^-	H	497.0151
ΔHexA(2S)?GlcNS(6S)	SO₃^-	SO₃^-	576.9719
HexA?aMan_R	H	H	340.0176
HexA(2S)?aMan_R	SO₃^-	H	420.0156
HexA?aMan(6S)_R	H	SO₃^-	420.0156
HexA(2S)?aMan(6S)_R	SO₃^-	SO₃^-	500.0136

Fig.1 SE?HPLC chromatograms of four heparin disaccharides with saturated structuresHexA(2S)-GlcNH3+(6S)-heparin(A); HexA-GlcNH3+(6S)-heparin(B); HexA(2S)-GlcNH3+-heparin(C) and HexA-GlcNH3+-heparin(D) were depolymerized by pH 4.0 HNO2 and then were separated by SE-HPLC. The fractions(A―D) indicated by the horizontal bars were individually pooled for RPIP-LC/MS-IT-TOF analysis. The arrows in panel (E) indicate the elution position of ΔHexA(2S)-GlcNH3+(6S)(1), ΔHexA-GlcNH3+(6S)(2), ΔHexA(2S)-GlcNH3+(3) and ΔHexA-GlcNH3+(4).

Fig.2 Characterization by RPIP?LC/MS?IT?TOF with MS(A―D) and EIC(A′―D′) detection for four saturated heparin disaccharides

Fig.3 UV absorption spectra of HexA(2S)?aMan(6S)R(a), HexA?aMan(6S)R(b), HexA(2S)?aManR(c) and HexA?aManR(d)

Table 2 UV 232 nm/UV 206 nm values of the unsaturated heparin disaccharides and the saturated heparin disaccharides

Disaccharide structure	UV _{232 nm}/UV _{206 nm}(%)	Disaccharide structure	UV _{232 nm}/UV _{206 nm}(%)
ΔHexA?GlcNH₃⁺(6S)	24.86	ΔHexA?GlcNS(6S)	47.55
ΔHexA(2S)?GlcNH₃⁺	19.93	ΔHexA(2S)?GlcNS	48.76
ΔHexA(2S)?GlcNH₃⁺(6S)	31.71	ΔHexA(2S)?GlcNS(6S)	53.50
ΔHexA?GlcNAc	27.16	HexA?aMan_R	4.12
ΔHexA?GlcNAc(6S)	55.96	HexA(2S)?aMan_R	4.50
ΔHexA(2S)?GlcNAc	52.95	HexA?aMan(6S)_R	5.10
ΔHexA(2S)?GlcNAc(6S)	46.83	HexA(2S)?aMan(6S)_R	16.27
ΔHexA?GlcNS	40.31

Fig.4 Sequencing of dp6?2b with structure of ΔHexA(2S)?GlcNH3+(6S)?HexA(2S)?GlcNS(6S)?HexA(2S)?GlcNH3+(6S)The dp6-2b was cleaved by HNO2(pH=4.0), and then separated by SE-HPLC, followed by RPIP-LC/MS-IT-TOF analysis(A); RPIP-LC chromatograms(B, C) and mass spectra(D, E) of the HNO2-generated dp2(B, D) and dp4(C, E) analyzed by RPIP-LC/MS-IT-TOF.

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