基于TMT10-plex等量标记结合SMOAC富集磷酸肽的定量磷酸化蛋白质组性能评价

doi:10.7503/cjcu20210406

高等学校化学学报 ›› 2021, Vol. 42 ›› Issue (12): 3624.doi: 10.7503/cjcu20210406

基于TMT10-plex等量标记结合SMOAC富集磷酸肽的定量磷酸化蛋白质组性能评价

赵欢欢, 李存玉, 金红()

复旦大学生物医学研究院, 上海 200032

收稿日期:2021-06-15 出版日期:2021-12-10 发布日期:2021-12-08
通讯作者: 金红 E-mail:jinhong@fudan.edu.cn
基金资助:
国家自然科学基金(31800691);国家重点研发计划项目(2017YFA0505100);国家重大研究计划项目(2017YFC0906600);上海市重大疾病蛋白质组研究专业技术服务平台服务能力提升项目(18DZ2292900)

Evaluation of Quantitative Phosphoproteomic Performance of Sequential Enrichment of Metal Oxide Affinity Chromatography for Phosphopeptides Using TMT 10-plex Isobaric Labeling

ZHAO Huanhuan, LI Cunyu, JIN Hong()

Institutes of Biomedical Sciences，Fudan University，Shanghai 200032，China

Received:2021-06-15 Online:2021-12-10 Published:2021-12-08
Contact: JIN Hong E-mail:jinhong@fudan.edu.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China(21765013);the Key Research and Development Projects of China(2017YFA0505100);the Critical Research Projects of China(2017YFC0906600);the Professional Technical Service Platform for Critical Diseases in Shanghai, China(18DZ2292900)

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摘要/Abstract

摘要：

探索并建立了一种快速、简便且高通量定量磷酸化蛋白质组的策略, 即采用连续互补的磷酸化富集方法SMOAC(Sequential enrichment of metal oxide affinity chromatography)结合TMT(Tandem mass tag)标记技术定量磷酸化蛋白质组学. 以3例经紫草素处理的及3例正常的人肝癌 HepG2 细胞为实验材料, 经Trypsin酶解后的肽段用TMT10-plex试剂进行等量标记, 标记肽段先经TiO₂富集, 收集包含磷酸化肽段的洗脱液, 接着用次氮基三醋酸铁(Fe-NTA)对TiO₂的流穿液和清洗液进行二次富集, 再次收集包含磷酸化肽段的洗脱液. 整个实验流程做2组, 对其中一组的2次洗脱液分别分析, 另一组的2次洗脱液合并分析. 在SMOAC的2次洗脱液合并分析中鉴定到4263个磷酸化蛋白上超过13000条磷酸化肽, 富集特异性>97%, 其中被定量的磷酸化蛋白为3848个, 占总鉴定量的90%以上. 研究结果表明, SMOAC 能够有效提高磷酸化肽段的鉴定效率, 且能与TMT等量标记试剂结合, 实现对少量蛋白样品的磷酸化蛋白定量分析.

关键词: 磷酸化蛋白质组学, 金属氧化物亲和色谱连续富集, Tandem mass tag技术, 质谱

Abstract:

A rapid， simple and high-flux strategy for quantitative phosphorylated proteomics was explored and developed， which was a kind of sequential enrichment method for complementary phosphopeptides labeled with Tandem mass tag（TMT） reagents. We cultured HepG2 cells treated with alkannin for 24 h and normal HepG2 cells for phosphorylation modification analysis. All the proteins were digested fully with Trypsin and labeled with TMT reagents， followed by desalting and vacuum drying. We implemented a SMOAC（Sequential enrichment of metal oxide affinity chromatography） strategy. We used firstly titanium dioxide（TiO₂） chromatography for phosphopeptides enrichment. Flow-through and wash fractions from TiO₂ were pooled and enriched secondly by ferrie nitrilotriacetate（Fe-NTA） chromatography. The platform equipped with EASY-nLC1200 and Orbitrap Exploris 480 mass spectrometry was applied to acquiring the phosphopeptides data of the HepG2 cells. We implemented two parallel sets of SMOAC strategy for 600 μg hybrid peptides labeled with TMT reagents. One of the sets， we pooled two kinds of eluate from SMOAC strategy for mass spectrometry analysis. Another of the sets， we analyzed the two kinds of eluate with mass spectrometry， respectively. Altogether we identified 4263 proteins and 16335 phosphopeptides， including 13347 phosphopeptides and 13851 phosphosites of 3848 proteins common to all channels from pooled eluate of SMOAC strategy. The specificity of the enrichment strategy was larger than 97% and 90% of the phosphoproteins identified were quantified. The study reveals SMOAC effectively improves the identification efficiency of phosphorylated peptides and also can quantify phosphorylation protein of a small amount of samples， combining with TMT reagents.

Key words: Phosphorylated proteomics, Sequential enrichment of metal oxide affinity chromatography, Tandem mass tag technology, Mass spectrometry

中图分类号:

O657

TrendMD:

赵欢欢, 李存玉, 金红. 基于TMT10-plex等量标记结合SMOAC富集磷酸肽的定量磷酸化蛋白质组性能评价. 高等学校化学学报, 2021, 42(12): 3624.

ZHAO Huanhuan, LI Cunyu, JIN Hong. Evaluation of Quantitative Phosphoproteomic Performance of Sequential Enrichment of Metal Oxide Affinity Chromatography for Phosphopeptides Using TMT 10-plex Isobaric Labeling. Chem. J. Chinese Universities, 2021, 42(12): 3624.

图/表 7

Table 1 TMT reagents of the corresponding samples

TMT reagent	126	127N	127C	128N	128C	131
No.1	C1	C2	C3	T1	T2	T3
No.2	C4	C5	C6	T4	T5	T6

Fig.1 Flow chart of analysis

Fig.2 Analysis results of the amount of peptides identified from TiO2 eluate and Fe eluate by LC?MS

Fig.3 Analysis results of the overlap of peptides and proteins identified from TiO2 eluate and Fe?NTA eluate by LC?MS

Fig.4 Comparison of the amount of phosphopeptides identified from two types of analysis

Fig.5 Scatterplots reflecting correlation of protein abundances in technical replicates

Fig.6 Scatter plot of enriched KEGG pathways statisticsNotes: The color and size of the dots represent the range of the -lgP and the number of the differentially expressed genes mapped to the indicated pathways, respectively.

参考文献 28

1	Hubbard M. J.， Cohen P.， Trends Biochem. Sci.， 1993， 18（5）， 172―177
2	Meyer L. J.， Gao J. J.， Xu D.， Thelen J. J.， Plant Physiol.， 2012， 159（1）， 517―528
3	Wilson J. T.， Villen J.， Gygi S. P.， J. Protoeme Res.， 2008， 7（3）， 1088―1097
4	Wen Q.， Caroline A. E.， Andrew L.， Trong K. P.， Phillip C. W.， Anal. Chim. Acta， 2020， 1129， 158―180
5	Thingholm T. E.， Larsen M. R.， Methods Mol. Biol.， 2016， 1355， 123―133
6	Alexandratos S. D.， Zhu X. P.， Materials（Basel）， 2017， 10（8）， 968
7	Post H.， Penning R.， Fitzpatrick M. A.， Garrigues L. B.， Wu W.， MacGillarry H. D.， Hoogenraad C. C.， Heck A. J. R.， Altelaar A. F. M.， J. Proteome Res.，2017， 16（2）， 728―737
8	Chen Y. M.， Hoehenwarter W.， Plant J.， 2019， 98（2）， 370―384
9	Wang B. C.， Wu H. M.， Yan Y. H.， Tang K. Q.， Ding C. F.， Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2020， 34（20）， e8881
10	Sun N. R.， Wu H.， Shen X. Z.， Mikrochim Acta， 2020， 187（3）， 195
11	Bodenmiller B.， Mueller L. N.， Mueller M.， Domon B.， Aebersold R.， Nat. Methods， 2007， 4（3）， 231―237
12	Nuhse T. S.， Stensballe A.， Jensen O. N.， Peck S. C.， Mol. Cell. Proteomics， 2003， 2（11）， 1234―1243
13	Humphrey S. J.， Karavel O.， James D. E.， Mann M.， Nat. Protoc.， 2018， 13（9）， 1897―1916
14	Kreuzer J.， Edwards A.， Haas W.，Methods Enzymol.， 2019， 626， 41―65
15	Diez I. A.， Govender I.， Naicker P.， Stoychev S.， Jordaan J.， Jensen O. N.， J. Proteome Res.， 2021， 20（1）， 453―462
16	Luo B.， Yu L. Z.， Li Z. Y.， He J.， Li C. J.， Lan F.， Wu Y.， J. Mater Chem. B， 2020， 8（36）， 8414―8421
17	Ren L. L.， Li C. Y.， Wang Y. L.， Teng Y.， Sun H. C.， Xing B. C.， Yang X.， Jiang Y.， He F. C.， Mol. Cell Proteomics， 2018， 17（6）， 1067―1083
18	Thingholm T. E.， Jensen O. N.， Robinson P. J.， Larsen M. R.， Mol. Cell Proteomics， 2008， 7（4）， 661―671
19	Oh Y.， Frank W. L.， Dean R. A.， Methods Mol. Biol.， 2018， 1848， 81―91
20	Melo-braga M. N.， Maria I. V.， Kulei K.， Larsen M. R.， Methods Mol. Biol.， 2021， 2261， 55―72
21	Engholm K. K.， Larsen M. R.， Methods Mol. Biol.， 2016， 1355， 161―177
22	Sun Z. Y.， Hamilton K. L.， Reardon K. F.， Anal. Biochem.， 2014， 445， 30―37
23	Huang F. K.， Zhang G. A.， Lawlor K.， Nazarian A.， Philip J.， Tempst P.， Dephoure N.， Neubert T. A.， J. Proteome Res.， 2017， 16（3）， 1121―1132
24	Han R. R.， Wei Y. M.， Xie Y. H.， Liu L. S.， Jiang C. D.， Yu Y. X.， PLoS One， 2020， 15（8）， e0237845
25	Ma Y. H.， Huang F.， Wang W. J.， J. Prac. Hepatol.， 2020， 23（4）， 471―475（马艳华，黄芬，王文尖. 实用肝脏病杂志， 2020， 23（4）， 471―475）
26	Aryal U. K.， Ross A. R.， Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2010， 24（2）， 219―231
27	Meng Y. Y.， Liu F.， Pang C. Y.， Fang S.， Song M. Z.， Wang D.， Li W. H.， Yu S. X.， J. Proteome Res.， 2011，10（12）， 5416―5432
28	Liu X. H.， Zheng W. M.， Wang W. S.， Shen H. L.， Liu L. X.， Lou W. H.， Wang X. L.， Yang P. Y.， Br. J. Cancer， 2017， 117， 1846―1854

[1]	朱凯, 利婕, 武潇逸, 胡薇薇, 吴冬梅, 虞诚潇, 葛志伟, 叶兴乾, 陈士国. 基于多孔石墨化碳柱-四极杆-飞行时间质谱解析甜菜果胶精细结构[J]. 高等学校化学学报, 2022, 43(6): 20220023.
[2]	梁群焘, 邹强, 林江慧, 刘树滔, 魏峥. 肝素非还原端饱和结构的紫外吸收研究及在肝素寡糖测序中的应用[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(6): 1776.
[3]	窦树珍, 王中舜, 吕男. 硅纳米结构对表面辅助激光解吸/电离质谱检测性能的提高[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(4): 1156.
[4]	郑海娇, 姜丽艳, 贾琼. 精氨酸功能化磁性纳米材料的制备及在磷酸化肽富集中的应用[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(3): 717.
[5]	王如新, 赵忠俊, 贺飞耀, 岳寒露, 邓辅龙, 李宏, 李雯雯, 段忆翔. C₁～C₃正构醛、醇在质子转移反应飞行时间质谱中的产物离子特征分析[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(12): 3632.
[6]	王柏纯, 袁雨欣, 闫迎华, 丁传凡, 唐科奇. 葡萄糖-6-磷酸功能化亲水磁探针：有效分离富集糖肽/磷酸肽的双用途亲和材料[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(10): 3062.
[7]	邓洁薇, 杨运云, 林里, 栾天罡. 表面修饰探针纳升电喷雾质谱脂质组学对大型溞和蚤状溞的快速鉴别[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(9): 2011.
[8]	潘梦芸, 冯流星, 李红梅. 高效液相色谱-非特异性同位素稀释质谱联用技术定量分析全血中总血红蛋白含量[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(9): 1983.
[9]	李肖乾, 张华, 路海健, 刘畅, 刘庆龙, 马夏禹, 方媛萍, 梁大鹏. 内部萃取电喷雾电离质谱对二氧化钛纳米线阵列光催化降解罗丹明B反应机理的研究[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(9): 2003.
[10]	王晓宇, 晏国全, 周新文, 杨芃原. 化学裂解结合生物质谱对多肽二硫键的定位[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(7): 1505.
[11]	何聿, 夏倩, 王文莉, 罗芳, 陈金凤, 郭雅婷, 王建, 林振宇, 陈国南. UPLC-QTOF-MS法研究甘油三酯作为水生环境中农药污染的潜在生物标志物[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(3): 431.
[12]	王天琦,余琼卫,冯钰锜. 基于氧化镍沉积硅胶固相萃取与液相色谱-质谱联用技术的2型糖尿病血清中咪唑丙酸的检测[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(2): 262.
[13]	艾万鹏, 宋诗瑶, 白玉, 刘虎威. 质谱技术在反应监测中的发展和应用[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(12): 2598.
[14]	王晓群, 黄光明. 三氟乙酸增强的解吸电喷雾电离质谱成像用于脂质空间分布研究[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(12): 2673.
[15]	赵孟欣, 孟哲, 李和平, 马宗琴, 詹海鹃, 刘万毅. 氧化石墨烯调控钼酸铋在可见光下选择性光催化降解环境水中的抗生素[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(11): 2479.

基于TMT10-plex等量标记结合SMOAC富集磷酸肽的定量磷酸化蛋白质组性能评价

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