红花均一多糖的结构表征及抑制HepG2增殖活性

doi:10.7503/cjcu20220600

摘要/Abstract

摘要：

对红花多糖进行分离提纯和结构表征, 探讨了红花均一多糖对HepG2肝癌细胞增殖的抑制作用. 采用水提醇沉法提取红花粗多糖；通过阴离子交换色谱柱和分子筛凝胶色谱柱对红花粗多糖进行分离纯化；采用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)对红花多糖的均一性以及分子量分布进行测定；采用单糖组成、甲基化及核磁共振波谱等方法对其进行结构解析. 通过体外细胞实验, 研究了红花多糖对于肿瘤细胞的作用. 从红花中分离得到一种均一多糖(CTPS-1A), 通过HPGPC计算得出其分子量为53800. CTPS-1A的单糖组成为 n(阿拉伯糖)∶n(半乳糖)=59.2∶40.8. 利用甲基化分析其连接方式为T-Galp, 1,3-Galp, 1,6-Galp, 1,3,6-Galp, T-Araf, 1,5-Araf和1,3,5-Araf. 研究结果表明, CTPS-1A为阿拉伯半乳聚糖(AG), 其主链由-β-Galp-(6→1)-β-Galp-(6→组成, 并在1,6-β-Galp的3位连有T-β-Galp, 1,3-β-Galp, T-α-Araf, 1,5-α-Araf, 1,3及5-α-Araf等分支. 体外培养HepG2细胞实验结果表明, CTPS-1A通过增强细胞核收缩和细胞凋亡对HepG2的生长具有抑制作用.

关键词: 红花, 多糖, 结构表征, 阿拉伯半乳聚糖, HepG2肝癌细胞

Abstract:

To isolate， purify and characterize the structure of polysaccharide from flowers of Carthamus tinctorius L.， and to investigate the inhibitory effect of its homogeneous polysaccharide on the proliferation of HepG2 hepatoma cells. The polysaccharides in flowers of Carthamus tinctoriusL. were extracted by water extraction and alcohol precipitation. The crude polysaccharides were separated and purified by anion exchange column and molecular sieve gel column. The homogeneity and molecular weight distribution were determined by high performance gel permeation chromatography（HPGPC）. Its structure was elucidated by monosaccharide composition， methylation， and nuclear magnetic resonance（NMR） methods. The inhibitory effect of flowers of Carthamus tinctoriusL. polysaccharide on tumor cells was studied by in vitro cell experiments. A homogeneous polysaccharide（CTPS-1A） was obtained. The molecular weight of CTPS-1A was 53800. The monosaccharide composition of CTPS-1A was analyzed by gas chromatography-mass spectrometer（GC-MS） and the monosaccharide composition was n（arabinose）∶n（galactose）=59.2∶40.8. By methylation analysis， the glycosidic linkages were T-Galp， 1，3-Galp， 1，6-Galp， 1，3，6-Galp， T-Araf， 1，5-Araf， and 1，3，5-Araf. The results showed that CTPS-1A was an arabinogalactan（AG）， its main chain was composed of -β-Galp-（6→1）-β-Galp-（6→， and T-β-Galp， 1，3-β-Galp， T-α-Araf， 1，5-α-Araf， 1，3，5-α-Araf were connected to the 3 position of 1，3，6-Galp. The results of in vitro culture of HepG2 cells showed that CTPS-1A inhibited the growth of HepG2 by enhancing nuclear contraction and apoptosis.

Key words: Carthamus tinctoriusL, Polysaccharide, Structural characterization, Arabinogalactan, HepG2 hepatoma cell

中图分类号:

O629.12

TrendMD:

徐永斌, 冯帅霞, 陈洁, 龚欢, 施松善, 王辉俊, 王顺春. 红花均一多糖的结构表征及抑制HepG2增殖活性. 高等学校化学学报, 2023, 44(4): 20220600.

XU Yongbin, FENG Shuaixia, CHEN Jie, GONG Huan, SHI Songshan, WANG Huijun, WANG Shunchun. Structural Characterization of a Homogeneous Polysaccharide Isolated from the Flower of Carthamus Tinctorius L. and Its Inhibitory Activity on HepG2 Proliferation. Chem. J. Chinese Universities, 2023, 44(4): 20220600.

图/表 10

Fig.1 Flow chart for the purification of CTPS⁃1A(A), elution curve of CTPS⁃1 on size⁃exclusion gel chromatography column(B) and HPLC analysis of CTPS⁃1A(C)

Fig.2 GC⁃MS of monosaccharide standards(A) and CTPS⁃1A(B)1. Rhamnose； 2. fucose； 3. arabinose； 4. xylose； 5. mannose； 6. glucose； 7. galactose.

Fig.3 GC chromatogram of CTPS⁃1A methylation(A) and mass spectra of PMAAs for T⁃Araf(B), 1,5⁃Araf(C), T⁃Galp(D), PMAAs for 1,3,5⁃Araf(E), 1,3⁃Galp(F), 1,6⁃Galp(G) and 1,3,6⁃Galp(H)

Table 1 GC-MS data for methylation analysis of CTPS-1A

Methylated suger	Linkage type	Molar fration（%）
2，3，5⁃Me₃⁃Araf	T⁃Araf	24.8
2，3⁃Me₂⁃Araf	1，5⁃Araf	29.8
3⁃Me₁⁃Araf	1，3，5⁃Araf	4.7
2，3， 4，6⁃Me₄⁃Galp	T⁃Galp	4.2
2，4，6⁃Me₃⁃Galp	1，3⁃Galp	3.1
2，3，4⁃Me₃⁃Galp	1，6⁃Galp	14.3
2，4⁃Me₂⁃Galp	1，3，6⁃Galp	19.1

Fig.4 1H NMR(A), 13C NMR(B), HSQC(C), 1H⁃1H COSY(D) and HMBC(E) spectrum of CTPS⁃1A

Table 2 13C NMR and 1H NMR data of CTPS-1A

δ
Residue	C⁃1/H⁃1	C⁃2/H⁃2	C⁃3/H⁃3	C⁃4/H⁃4	C⁃5/H⁃5	C⁃6/H⁃6
T⁃α⁃Araf	110.3/5.24	82.5/4.22	77.9/4.01	85.0/4.14	62.2/3.72， 3.83	—/—
1，5⁃α⁃Araf	108.6/5.09	81.9/4.13	77.9/3.96	85.0/4.08	67.9/3.82， 3.90	—/—
1，3，5⁃α⁃Araf	108.1/5.15	82.5/4.14	85.1/4.09	83.2/4.3	68.0/3.84， 3.93	—/—
T⁃β⁃Galp	105.4/4.62	74.0/3.64	74.8/3.88	70.6/4.02	76.7/3.73	62.4/3.82， 3.84
1，3⁃β⁃Galp	104.9/4.69	73.1/3.78	81.2/3.74	70.1/3.89	75.9/3.81	62.3/3.89， 3.83
1，6⁃β⁃Galp	104.3/4.46	73.0/3.55	75.6/3.70	71.0/3.64	74.6/3.70	70.1/3.74， 3.82
1，3，6⁃β⁃Galp	104.4/4.52	73.8/3.66	83.4/3.91	69.9/4.13	74.9/3.94	69.9/3.73， 3.84

Fig.5 Possible chemical structure of CTPS⁃1A

Fig.6 Effects of CTPS, CTPS⁃W, CTPS⁃1, CTPS⁃2, CTPS⁃3 and CTPS⁃5(200 μg/mL) on the viability of HepG2 cells(A), and effects of the concentrations of CTPS⁃1A(0—400 μg/mL) on the viability of HepG2 cells(B) and L02 cells(C)Each value represents the mean±SD（n=5）. **P<0.01， ***P<0.001 compared to the control group.

Fig.7 Microscope images(A—D) and fluorescence microscope images(E—H) of HepG2 cells treated with different concentrations of CTPS⁃1A for 24 h（E—H） HepG2 cells were stained with Hoechst 33258. Concentrations of CTPS-1A/（μg·mL-1）：（A， E） 0；（B， F） 100；（C， G） 200；（D， H） 400.

Fig.8 Flow cytometry spectrum(A) and apoptosis rate(B) of HepG2 cells treated with different concentrations of CTPS⁃1A for 24 hConcentrations of CTPS-1A/（μg·mL-1）：（A1） 0；（A2） 100；（A3） 200；（A4） 400. Each value represents the mean±SD（n=3）. **P<0.01 compared to the control group.

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