外源N6-甲基腺嘌呤掺入对细胞mRNA表达的影响

doi:10.7503/cjcu20220173

摘要/Abstract

摘要：

N⁶-甲基腺嘌呤（m⁶A）是一种真核细胞中最广泛存在且可逆的内源mRNA修饰，它在决定RNA命运中起着至关重要的作用. 本文发现外源m⁶A可以通过补救合成途径掺入到细胞mRNA，并评估了外源m⁶A掺入mRNA后所产生的生物学效应. 首先，发现用m⁶A核苷处理HeLa细胞会显著改变细胞的形态和活力; 然后，合成了同位素标记的d₃-m⁶A(N⁶-甲基-d₃-腺苷)，并采用质谱法检测了不同处理时间下细胞mRNA中d₃-m⁶A的掺入率; 随后，使用RNA测序（RNA-seq）研究外源m6A掺入的生物学效应. 结果表明，掺入外源m⁶A后的细胞有数千个基因产生差异表达，并且这些差异表达的基因在核糖体生物发生、 mRNA代谢过程和细胞形态发生分化等途径中显著富集. 研究结果表明，外源m⁶A可以通过代谢途径掺入细胞内源mRNA中，并可以影响细胞基因表达.

关键词: m⁶A修饰, mRNA甲基化, d₃-m⁶A同位素标记, mRNA代谢标记

Abstract:

N⁶-methyladenosine（m⁶A） is the most prevalent and reversible internal mRNA modification in eukaryotic cells， and plays an essential role in RNA fate determination. In this work， we studied the exogenous incorporation of m⁶A into cellular mRNA through salvage pathway and evaluated its resultant biological effects. First， we found that feeding of HeLa cells with m⁶A nucleoside significantly altered cell morphology and viability. We then synthesized isotope-labelled d₃-m⁶A（N⁶-methyl-d₃-adenosine） and examined the d₃-m⁶A incorporation rate in cellular mRNA along with incubation time using mass spectrometry. Next， RNA sequencing（RNA-seq） was used to study the biological effects of exogenous m⁶A incorporation. Finally， thousands of genes were found to be differentially expressed， and were dramatically enriched in pathways such as ribosome biogenesis， mRNA metabolic process and cell morphogenesis differentiation. All these results suggested that exogenous m⁶A could be incorporated into mRNAs through a metabolic pathway to influence cellular gene expression.

Key words: m⁶A Modification, mRNA Methylation, d₃-m⁶A Isotope labelling, mRNA Metabolic labelling

中图分类号:

O652

TrendMD:

张青一, 曹婕, 舒潇, 刘建钊. 外源N⁶-甲基腺嘌呤掺入对细胞mRNA表达的影响. 高等学校化学学报, 2023, 44(3): 20220173.

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图/表 4

Fig.1 Cell morphology of HeLa cells treated with m6A at different concentrations for 12 h（A） DMSO as control；（B） 50 μmol/L m6A；（C） 500 μmol/L m6A；（D） 1 mmol/L m6A.

Fig.2 Mass spectrometry characterization of d3⁃m6A/A ratio in mRNA of HeLa cells（A） and cytotoxicity of d3⁃m6A in HeLa cells（B）（A） The cells were treated with 500 μmol/L or 1 mmol/L d3⁃m6A for different time intervals；（B） the cells were treated with 500 μmol/L d3⁃m6A for different time intervals. Data are expressed as mean±SD， n=3.

Fig.3 RNA⁃seq analysis showing the abundance change of mRNA transcripts under the metabolic incorporation of d3⁃m6A into mRNA of HeLa cells（A） The number of differentially expressed genes in samples under the metabolic feeding of d3-m6A for different time intervals versus control（Ctrl） without treatment. P1： 500 μmol/L d3-m6A， 24 h treatment； P7： 500 μmol/L d3-m6A， 168 h treatment. UP： up-regulated genes； DOWN： down-regulated genes. （B） The percentage of m6A-containing target genes among the total differentially expressed genes of the samples. （C） The heatmap and cluster analyses of differentially expressed genes in the samples.

Fig.4 Gene ontology analysis of differentially expressed genes in d3⁃m6A⁃treated HeLa cells for different time intervals（A） P1-UP；（B） P1-DOWN；（C） P7-UP；（D） P7-DOWN. P1： 500 μmol/L d3-m6A， 24 h treatment； P7： 500 μmol/L d3-m6A， 168 h treatment； UP： up-regulated genes； DOWN： down-regulated genes.

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外源N⁶-甲基腺嘌呤掺入对细胞mRNA表达的影响

Effects of Exogenous N⁶-methyladenosine Incorporation on the Expression of Cellular mRNA Transcripts

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