水溶性香豆素荧光底物的制备及在液滴数字式检测中的应用

doi:10.7503/cjcu20210459

摘要/Abstract

摘要：

4-甲基伞形酮磷酸酯(4-MUP)是一类重要的荧光底物, 由于具有较高的疏水性, 荧光信号易在液滴间扩散而限制了其在液滴微流控芯片领域中的应用. 本文首先通过修饰7-羟基香豆素-4-乙酸, 制备了具有较高水溶性的新型底物分子7-二羟基磷酸酯香豆素-4-乙酸甲酯; 进而以7-二羟基磷酸酯香豆素-4-乙酸甲酯为底物, 以球刷酶(荷载大量碱性磷酸酶的聚电解质纳米颗粒, SP-AKP)为模式酶, 建立了基于液滴微流控的单SP-AKP数字式检测体系. 结果表明, 该水溶性香豆素荧光底物具有与传统4-MUP底物相似的荧光光谱和酶催化性能. 传统4-MUP酶促荧光产物5 min即在液滴中发生明显扩散, 而该水溶性香豆素荧光底物酶催化后产生的荧光产物7-羟基香豆素-4-乙酸甲酯在24 h后仍未观察到明显扩散现象, 具有优异的抑制荧光扩散性能. 在基于液滴微流控芯片的单SP-AKP数字式检测中, 对SP-AKP的检测限可达29.9 amol/L, 同时有效提升了检测时间的可操作性与数字式信号读取的准确性. 新型水溶性香豆素荧光底物有望替代4-MUP应用于以基于液滴数字式超敏生物检测为代表, 在液滴分区实现酶促反应进行超灵敏检测的众多检测领域中.

关键词: 香豆素, 亲水性底物, 液滴酶促数字式检测, 球刷酶, 液滴荧光扩散

Abstract:

4-Methylumbelliferyl phosphate is one of the most important fluorescent substrate， but its application in the droplet based microfluidic field is limited by its high hydrophobicity and diffusion property between droplets. In this paper， a novel high water solubility fluorescent substrate 7-（dihydroxyphosphoryloxyl） coumarin-4-acetic acid methyl ester was synthesized by modifying 7-hydroxycoumarin-4-acetic acid. The droplet microfluidics based single SP-AKP digital detection system was established with prepared 7-（dihydroxyphosphoryloxyl） coumarin-4-acetic acid methyl ester as the fluorescent substrate， and the spherical brush enzyme（polyelectrolyte nanoparticals loaded with a large number of alkaline phosphatases， SP-AKP） prepared by our research group as the model enzyme. The results showed that the new water-soluble coumarin fluorescent substrate had similar fluorescence spectroscopy and enzyme catalytic performance to traditional 4-MUP substrate. Compared with the enzyme-catalyzed fluorescent product of traditional substrate 4-MUP， which diffused signi- ficantly in droplets within 5 min， the enzyme-catalyzed fluorescent product（7-hydroxycoumarin-4-acetic acid） of the new fluorescent substrate had excellent diffusion suppression performance， which was stable in the droplet within 24 h with no obvious diffusion phenomenon. Further application in droplet based digital enzyme-linked immunosorbent assay of single SP-AKP indicated this new substrate could reach a low limit of detection of 29.9 amol/L， with flexible detection time and high signal accuracy. This new water-soluble coumarin fluorescent substrate was expected to replace 4-MUP in the applications such as ultrasensitive droplet based biological detection and many other fields that require enzymatic reaction in the droplet partitions.

Key words: Coumarin, Hydrophilic substrate, Droplet based enzymatic digital detection, Spherical brush enzyme, Fluorescence diffusion in droplets（Ed： L, H, W, K）

中图分类号:

O652

TrendMD:

匡小军, 伊京伟, 方晓霞, 赖东梅, 徐宏. 水溶性香豆素荧光底物的制备及在液滴数字式检测中的应用. 高等学校化学学报, 2021, 42(11): 3537.

KUANG Xiaojun, YI Jingwei, FANG Xiaoxia, LAI Dongmei, XU Hong. Preparation of Water-soluble Coumarin Fluorescent Substrate and Its Application in Droplet Based Digital Detection. Chem. J. Chinese Universities, 2021, 42(11): 3537.

图/表 6

Scheme 1 Schematic of droplet based digital detection

Scheme 2 Syntheses of alkaline phosphatase substrate 7?(dihydroxyphosphoryloxyl) coumarin?4?acetic acid methyl ester(C?4)

Fig.1 Basic property characterization of 4?MU, C?2, 4?MUP, C?4 and SP?AKP（A） The fluorescence spectra and partition coefficients（lg D） of 4?MU and C?2；（B） the fluorescence intensity standard curves of 4?MU and C?2；（C） the Michaelis?Menten equation of corresponding substrate C?4 and 4?MUP；（D） the catalytic activity comparison of AKP and SP?AKP.The concentrations of AKP and SP?AKP are 1×10-6 mg/mL and 12.17×10-6 mg/mL， respectively.

Fig.2 Characterization of fluorescent product(C?2 and 4?MU) leakage in droplets(A) Fluorescence images of 4?MU in droplets at 0(A1), 5(A2), 10(A3) and 20 min(A4). (B) Fluorescence images of C?2 in droplets at 0 min (B1), 30 min (B2), 60 min (B3) and 24 h (B4). Corresponding fluorescence intensity distribution of droplets using 4?MU(C) and C?2(D). Different color indicates different incubation times after droplet generation. (E) Evolution of positive droplet fraction using C?2 and 4?MU over time.The ordinate and horizontal axis indicate the proportion of positive droplets and incubation time, respectively.

Fig.3 Characterization of 4?MUP and C?4 in droplets over time(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(A1), 5 min(A2), 10 min(A3), and 30 min(A4) incubation of 4?MUP substrate under λ=0.04. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(B1), 10 min(B2), 20 min(B3), and 60 min(B4) incubation of C?4 substrate under λ=0.55. Summary of florescence distribution after different incubation time using 4?MUP(C) and C?4(E). Different color indicates different incubation times after droplet generation. The experimental λ of 4?MUP(D) and C?4(F) over time.

Fig.4 Droplet based digital detection of SP?AKP using 4?MUP and C?4(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) of SP?AKP at λT=0.0007(A1), 0.007(A2), 0.069(A3), and 0.312(A4) using 4?MUP after 10 min incubation. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images (insert pictures) of SP?AKP at λT=0.0007(B1), 0.007(B2), 0.069(B3), and 0.312(B4) using C?4 after 20 min incubation. The experimental λTversus theoretical λT using 4?MUP(C) and C?4(E). The ordinate and horizontal axis indicate the experimental λT and the theoretical λT, respectively. The experimental λTversus SP?AKP concentration using 4?MUP(D) and C?4(F).

参考文献 20

1	Ponomarenko E. A.， Poverennaya E. V.， Ilgisonis E. V.， Pyatnitskiy M. A.， Kopylov A. T.， Zgoda V. G.， Lisitsa A. V.， Archakov A. I.， Int. J. Anal. Chem.， 2016， 2016， 7436849
2	Rissin D. M.， Kan C. W.， Campbell T. G.， Howes S. C.， Fournier D. R.， Song L.， Piech T.， Patel P. P.， Chang L.， Rivnak A. J.， Ferrell E. P.， Randall J. D.， Provuncher G. K.， Walt D. R.， Duffy D. C.， Nat. Biotechnol.， 2010， 28（6）， 595—600
3	Witters D.， Sun B.， Begolo S.， Rodriguez⁃Manzano J.， Robles W.， Ismagilov R. F.， Lab Chip，2014， 14（17）， 3225—3232
4	Cohen L.， Cui N.， Cai Y.， Garden P. M.， Li X.， Weitz D. A.， Walt D. R.， ACS Nano，2020， 14（8）， 9491—9501
5	Yu M.， Xia T.， Bai W.， Ji J.， Wang H.， Huang Y.， Deng S.， Ma K.， Su Y.， Wan Y.， Chem. Res. Chinese Universities，2020， 36（2）， 291—295
6	Ahmed K.， Muhammad A.， Mohammed Y.， Masood A. S.， Samar A.， Chem. Res. Chinese Universities，2021， 37（3）， 629—638
7	Obayashi Y.， Iino R.， Noji H.， Analyst，2015， 140（15）， 5065—5073
8	Gruner P.， Riechers B.， Semin B.， Lim J.， Johnston A.， Short K.， Baret J. C.， Nat. Commun.，2016， 7， 10392
9	Woronoff G.， Harrak A. E.， Mayot E.， Schicke O.， Miller O. J.， Soumillion P.， Griffiths A. D.， Ryckelynck M.， Anal. Chem.，2011， 83（8）， 2852—2857
10	Ma F.， Fischer M.， Han Y.， Withers S. G.， Feng Y.， Yang G. Y.， Anal. Chem.，2016， 88（17）， 8587—8595
11	Gao Z.， Yi J.， Zhao J.， Gu H.， Zhou H.， Xu H.， Sensor. Actuat. B： Chem.，2020， 324， 128716
12	Wu N.， Courtois F.， Zhu Y.， Oakeshott J.， Easton C.， Abell C.， Electrophoresis，2010， 31（18）， 3121—3128
13	Courtois F.， Olguin L. F.， Whyte G.， Theberge A. B.， Huck W. T. S.， Hollfelder F.， Abell C.， Anal. Chem.，2009， 81， 3008—3016
14	Sandoz P. A.， Chung A. J.， Weaver W. M.， Carlo D. D.， Langmuir，2014， 30（23）， 6637—6643
15	Najah M.， Mayot E.， Mahendra⁃Wijaya I. P.， Griffiths A. D.， Ladame S.， Drevelle A.， Anal. Chem.，2013， 85（20）， 9807—9814
16	Zhu Q.， Uttamchandani M.， Li D.， Lesaicherre M. L.， Yao S. Q.， Org. Lett.，2003， 5（8）， 1257—1260
17	Qu Z.， Chen K.， Gu H.， Xu H.， Bioconjugate Chem.，2014， 25（2）， 370—378
18	Holmes C. P.， Macher N.， Grove J. R.， Jang L.， Irvine J. D.， Bioorg. Med. Chem. Lett.，2008， 18（11）， 3382—3385
19	Huque F. T. T.， Jones K.， Saunders R. S.， Platts J. A.， J. Fluorine Chem.，2002， 115， 119—128
20	Wang Y.， Gao Z.， Yi J.， Zhou H.， Fang X.， Xu H.， Zhao J.， Gu H.， RSC Adv.，2019， 9（41）， 23658—23665

[1]	唐倩, 但飞君, 郭涛, 兰海闯. 喹啉酮-香豆素类Hg²⁺比色荧光探针的合成及应用[J]. 高等学校化学学报, 2022, 43(2): 20210660.
[2]	李伦, 张静妍, 罗静, 刘仁, 朱乙. UV/Vis-LED激发的香豆素吡啶鎓盐光引发剂的合成及性能[J]. 高等学校化学学报, 2022, 43(10): 20220178.
[3]	赵慧君, 吴通, 孙玥, 段炼, 马嫣宇. 基于香豆素的比率型荧光探针对溶液及气相中三氟化硼的检测[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(8): 2422.
[4]	马玉坤, 王海君, 郭梦岩. 狼毒乙素分子印迹膜荧光传感器的制备及在中药材检测中的应用[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(7): 1381.
[5]	韩涛, 蔡小霞, 李聪, 乔从德, 赵辉. 生物基氢化香豆素增韧环氧树脂的制备及性能[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(5): 1043.
[6]	韩瑞霞, 吕继涛, 张淑贞. 一种适用于复杂异相体系中羟基自由基定量检测的探针分子—香豆素[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(12): 2658.
[7]	杨树平, 韩立军, 潘燕, 王大奇, 王南南, 王婷. 8-或6-(3-氯苯甲酰)香豆素衍生物的合成、表征、生物活性及与牛血清白蛋白的相互作用[J]. 高等学校化学学报, 2013, 34(2): 364.
[8]	董社英, 李靖, 黄廷林. 新型4-羟基香豆素衍生物的微波合成及其光谱性质[J]. 高等学校化学学报, 2009, 30(8): 1516.
[9]	马向霞 ; 何锡文 ; 张茉 ; 李文友 ; 张玉奎 . 香豆素-3-羧酸分子印迹聚合物复合膜对底物的结合及渗透选择性质的研究[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27(7): 1237.
[10]	王欢; 薛腾; 张爱健; 张丽; 陆嘉星. 香豆素在离子液体(BMIMBF₄)中的电还原行[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27(6): 1135.
[11]	李军,刘祥军,赵睿, 熊少祥,马会民,吕强,许莉 . 7-甲氧基香豆素-3-羧酸-N-琥珀酰亚胺酯用于神经肽的标记与分析[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27(12): 2297.
[12]	刘雪锋夏咏梅曹玉华方云邹珠燕毛本刚丁漪. 香豆素类中药有效成分与牛血清白蛋白结合的构效关系[J]. 高等学校化学学报, 2006, 27(1): 150.
[13]	庞美丽, 王永梅, 孟继本, 王积涛. 具有光致变色和发光性能的有机化合物的合成及其性能研究[J]. 高等学校化学学报, 2000, 21(6): 903.
[14]	李隆弟, 吴应光, 张众笑, 童爱军. (7-甲氧基-4-亚甲基)香豆素基-单氮杂-18-冠-6的阳离子识别性能研究[J]. 高等学校化学学报, 2000, 21(12): 1824.
[15]	杜大明, 王永梅, 孟继本. 微环境对长链香豆素酯光化学和光物理过程的影响[J]. 高等学校化学学报, 1998, 19(10): 1611.