纸质空心金纳米笼SERS传感器的制备及对非小细胞肺癌患者痰液中miRNAs的快速高灵敏检测

doi:10.7503/cjcu20210280

高等学校化学学报 ›› 2021, Vol. 42 ›› Issue (8): 2393.doi: 10.7503/cjcu20210280

纸质空心金纳米笼SERS传感器的制备及对非小细胞肺癌患者痰液中miRNAs的快速高灵敏检测

薛谨¹, 曹小卫²(), 刘依帆³(), 王敏¹

^1.扬州大学广陵学院, 扬州 225001
^2.扬州大学医学院转化医学研究中心, 扬州 225001
^3.大连医科大学第一临床学院, 大连 116000

收稿日期:2021-04-25 出版日期:2021-08-10 发布日期:2021-08-05
通讯作者: 刘依帆 E-mail:cxw19861121@163.com;liuyifan0667@sina.com
作者简介:曹小卫, 男, 博士, 副教授, 主要从事纳米医学传感、肿瘤的诊断与治疗方面的研究. E⁃mail: cxw19861121@163.com
基金资助:
国家自然科学基金(81701825);扬州大学广陵学院自然科学项目(ZKYB180016)

Preparation of Paper Hollow Gold Nanocage SERS Sensor and Its Rapid and Highly Sensitive Detection for miRNAs in Sputum of Patients with Non-small Cell Lung Cancer

XUE Jin¹, CAO Xiaowei²(), LIU Yifan³(), WANG Min¹

^1.Guangling College，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China
^2.Institute of Translational Medicine，Medical College，Yangzhou University，Yangzhou 225001，China
^3.The First Clinical College，Dalian Medical University，Dalian 116000，China

Received:2021-04-25 Online:2021-08-10 Published:2021-08-05
Contact: LIU Yifan E-mail:cxw19861121@163.com;liuyifan0667@sina.com
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China(81701825);the Natural Science Program of Guang?ling College of Yangzhou University, China(ZKYB180016)

摘要/Abstract

摘要：

利用油水界面自组装法获得了单层空心金纳米笼(HGNCs)阵列基底. 通过时域有限差分方法, 证明HGNCs间隙可提供大量“热点”, 从而使基底表现出优异的表面增强拉曼散射(SERS)性能. 同时, 将拉曼信号分子标记的发夹结构DNA与基底链接, 在与目标miRNAs互补杂交后进行SERS信号检测. 结果表明, 基于单层HGNCs阵列基底的SERS传感器具有优良的灵敏度、可重复性和特异性, 对痰液中miR-196a和miR-21的检出限分别为10.00和36.15 amol/L. 为了验证该SERS传感器在临床检测中的准确性, 利用其对非小细胞肺癌(NSCLC)患者痰液中miR-196a和miR-21进行检测, 并将结果与实时定量多聚核苷酸链式反应技术(qRT-PCR)的检测结果进行了比较. 2种检测方法均显示NSCLC患者痰液中miR-196a和miR-21的表达高于健康人, 检测结果间没有统计学差异, 且相对标准偏差均低于10%. 因此, 纸质空心金纳米笼SERS传感器在NSCLC诊断中具有应用价值, 可能成为生物医学诊断领域miRNAs研究的一个替代工具.

关键词: 空心金纳米笼, 油水界面自组装, 表面增强拉曼光谱, 柔性基底

Abstract:

The abnormal expression of nucleic acid is closely related to the occurrence and development of tumor. Detecting the expression of micro-RNA（miRNAs） markers is of great significance for the diagnosis and treatment of non-small cell lung cancer（NSCLC）. In this work， the monolayer hollow gold nanocages（HGNCs） array substrate was fabricated by the self-assembly method at the oil-water interface. It was proved that the HGNCs gap provided a large number of “hot spots” by FDTD method， which made the substrate exhibit an excellent surface-enhanced Raman scattering（SERS） performance. At the same time， the hairpin DNA labeled by Raman signal molecule was linked with the substrate， and then the SERS signal was detected after complementary hybridization with the target miRNAs. The detection limits of miR-196a and miR-21 in sputum were 10.00 and 36.15 amol/L， respectively. In order to verify the accuracy of the sensor in clinical detection， the SERS sensor was used to detect miR-196a and miR-21 in sputum of patients with NSCLC， and the results were compared with those of real-time quantitative polynucleotide chain reaction technology. There were no significant differences between the results of the two detection methods， which both showed that the expressions of miR-196a and miR-21 in sputum of NSCLC patients were higher than those of healthy people， and the relative standard deviations were less than 10%. Therefore， the paper HGNCs SERS sensor has potential application in NSCLC diagnosis， and may become an alternative tool for miRNAs research in biomedical diagnosis field.

Key words: Hollow gold nanocages, Self-assembly at oil-water interface, Surface-enhanced Raman spectroscopy（SERS）, Flexible substrate

中图分类号:

O652

TrendMD:

薛谨, 曹小卫, 刘依帆, 王敏. 纸质空心金纳米笼SERS传感器的制备及对非小细胞肺癌患者痰液中miRNAs的快速高灵敏检测. 高等学校化学学报, 2021, 42(8): 2393.

XUE Jin, CAO Xiaowei, LIU Yifan, WANG Min. Preparation of Paper Hollow Gold Nanocage SERS Sensor and Its Rapid and Highly Sensitive Detection for miRNAs in Sputum of Patients with Non-small Cell Lung Cancer. Chem. J. Chinese Universities, 2021, 42(8): 2393.

图/表 11

Fig.1 Preparation process of filter paper based SERS sensor(A) and its application in simultaneous detection of miR?196a and miR?21 expression levels in sputum of patients with NSCLC(B)

Table 1 Sequences of oligonucleotides used in the experiment

Name	Sequence
miR?21	5′?UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA?3′
miR?196a	5′?UAGUAGUUUCACUGUGAUUCGGG?3′
hpDNA（miR?21）	5′?SH?TCAACATCAGTCTGATAAGCTACGACATCTAACTAGCTTATCAGACT?cy5?3′
hpDNA（miR?196a）	5′?SH?CCCGAAYCACAGTGAAACTACTAAGAGTAAGAGACCTTTAA?5FAM?3′
Single?base mismatch（MT1）	5′?UAGCUUAUCAGACUGCUGUUGA?3′ and 5′?UAGUAGUUUCACUCUGAUUCGGG?3
Three?base mismatch（MT3）	5′?UACCUUAUCAGACAGAUGCUGA?3′ and 5′?UAGUAGUCUCACUAUGAUUCCGG?3′

Fig.2 Characterization of HGNCs(A) TEM image; (B) SEM image; (C) high resolution TEM image; (D) SAED pattern; EDS images of Au(E) and Ag(F) element;(G) UV?Vis?NIR absorption spectrum of HGNCs; (H) Raman spectra of Raman reporters and Raman reporters labeled HGNCs.

Fig.3 FDTD simulation of HGNCs(A) SEM image of monolayer HGNCs array; (B) FDTD simulation of monolayer HGNCs array(plane); (C) cross section SEM image of monolayer HGNCs array; (D) FDTD simulation of monolayer HGNCs array(cross section).

Fig.4 Characterization of HGNCs array substrates(A) SEM and AFM images of HGNCs substrate; (B) SERS mapping of Cy5 at 1597 cm-1; (C) SERS spectra of substrate at different concentrations of 5?FAM and Cy5(10-4―10-10 mol/L); (D) relationship between SERS intensity and logarithm of Cy5 concentration at 1597 cm-1; (E) SERS spectra of HGNCs substrate after 1, 7 and 14 d; (F) broken line of SERS signal intensity at 1597 cm-1.

Fig.5 Optimization of hpDNA assembly time corresponding to miR?196a(A) and miR?21(B), optimization of hybridization time between miR?196a and hpDNA(C) and optimization of hybridization time between miR?21 and hpDNA(D)

Fig.6 Characterization of selectivity and reproducibility(A) SERS spectra of specific detection; peak statistics of corresponding characteristic peaks of 1174 cm-1(B) and 1597 cm-1(C); (D) SERS spectra of reproducibility detection; peak statistics of corresponding characteristic peaks of 1174 cm-1(E) and 1597 cm-1(F).(B) a. MT1, b. MT3, c. random, d. blank, e. miR?196a?5p; (C) a. MT1, b. MT3, c. random, d. blank, e. miR?125a?5p.

Fig.7 Quantitative determinations of miR?196a and miR?21(A) SERS spectra miR?196a and miR?21 with different concentrations in sputum samples; (B) calibration curve between characteristic peak intensity at 1174 cm-1 and logarithm of miR?196a concentration; (C) calibration curve between characteristic peak intensity at 1334 cm-1 and logarithm of miR?21 concentration.

Table 2 Comparisons of the paper HGNCs SERS sensor with the previously reported methods

miRNA	Method	Linear range	LOD	Analysis time/ min	Reference
miR?21	Phosphorescence	0.25─40 nmol/L	0.16 nmol/L	130	［26］
	SERS	10^-15─10^-12 mol/L	0.12 fmol/L	190	［27］
	Electrochemical impedance spectroscopy	10 fmol/L─50 pmol/L	4.63 fmol/L	150	［28］
	Paper HGNCs SERS sensor	10^-16 ─10^-10 mol/L	36.15 amol/L	120	This work
miR?196a	SERS	10^-15─10^-10 mol/L	130.00 amol/L	360	［29］
	A power?free microfluidic chip	0.001─1000 pmol/L	0.045 pmol/L	80	［30］
	Paper HGNCs SERS sensor	10^-16─10^-10 mol/L	10.00 amol/L	120	This work

Fig.8 Practical samples analysis SERS(A) Spectra of miR?196a and miR?21 in sputum of NSCLC patients and healthy people; expression levels of miR?196a(B) and miR?21(C) in sputum of healthy people and NSCLC patients detected by SERS and qRT?PCR, respectively.

Table 3 Comparisons of miR-196a and miR-21 expression levels in sputum samples detected by SERS and qRT-PCR

Sample	SERS/（fmol?L^-1）		qRT?PCR/（fmol?L^-1）		RSD（%）		t		P
Sample	miR?196a	miR?21	miR?196a	miR?21	miR?196a	miR?21	miR?196a	miR?21	miR?196a	miR?21
Healthy people	3.095	4.562	3.194	4.216	4.402	5.574	-3.216	4.561	>0.05	>0.05
NSCLC patients	20.447	21.866	19.131	19.936	4.702	6.529	2.973	3.412	>0.05	>0.05

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