基于高内吞效率的核酸适体构建LYTACs嵌合体以增强白血病细胞膜蛋白的降解

doi:10.7503/cjcu20260017

摘要/Abstract

摘要：

基于溶酶体靶向嵌合体(LYTACs)技术，以具有高内吞效率的转铁蛋白受体(Transferrin receptor 1， TfR1/CD71)特异性核酸适体HG9作为识别模块，通过共价连接溶酶体导向配体三乙酰半乳糖胺(tri-GalNAc)，设计合成了一种新型双功能嵌合分子HG9-10-tri，旨在实现CD71的高效、特异性降解. 研究结果表明，通过筛选获得HG9与tri-GalNA之间最佳连接子长度，且该嵌合分子在不改变其稳定性及对人髓性单核细胞白血病细胞(MV4-11)亲和力的前提下，能够特异性识别急性髓细胞性白血病(AML)细胞系，并通过去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)介导的内吞-溶酶体途径显著下调细胞表面CD71蛋白表达水平，降解作用呈现明显的时间和浓度依赖性. 并且CD71降解能够有效抑制MV4-11细胞的活力，并进一步诱导细胞凋亡与G1期周期阻滞，为治疗CD71高表达的急性髓系白血病提供了新策略.

关键词: 转铁蛋白受体（CD71）, 细胞膜降解, 溶酶体靶向嵌合体(LYTACs), 核酸适体, 三乙酰半乳糖胺

Abstract:

In this study， we developed a novel bifunctional lysosome-targeting chimera（LYTAC）， designated HG9-10-tri， by covalently conjugating tri-GalNAc（a lysosome-trafficking ligand） to HG9， an aptamer that binds transferrin receptor 1（TfR1/CD71） with high affinity and internalization efficiency. This chimeric molecule was designed to achieve potent and selective degradation of CD71. Following the optimization of the linker length between HG9 and tri-GalNAc， we demonstrated that HG9-10-tri retains unaltered stability and binding affinity for human acute monocytic leukemia（MV4-11） cells while specifically recognizing acute myeloid leukemia（AML） cell lines. Mechanistically， HG9-10-tri engages the asialoglycoprotein receptor（ASGPR） to trigger endocytosis and lysosomal trafficking， resulting in significant downregulation of cell surface CD71 protein levels in a time- and concentration- dependent manner. Functionally， CD71 degradation suppressed MV4-11 cell viability， induced apoptosis， and triggered G1 phase cell cycle arrest. Collectively， these findings establish HG9-10-tri as a promising therapeutic strategy for CD71-overexpressing acute myeloid leukemia.

Key words: CD71, Cell membrane degradation, Lysosome-targeting chimera（LYTACs）, Aptamer, Triacetylgalactosamine（tri-GalNAc）

中图分类号:

TrendMD:

陈卓然, 龚玲玉, 艾立丽, 张鹏, 周艳华. 基于高内吞效率的核酸适体构建LYTACs嵌合体以增强白血病细胞膜蛋白的降解. 高等学校化学学报, 2026, 47(7): 20260017.

CHEN Zhuoran, GONG Lingyu, AI Lili, ZHANG Peng, ZHOU Yanhua. High-internalization-efficiency Aptamer-based LYTACs Chimera for Enhanced Degradation of Leukemia Cell Membrane Proteins. Chem. J. Chinese Universities, 2026, 47(7): 20260017.

图/表 6

Table 1 Primer sequences used in this study

Aptamer	Sequence
HG9	GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCC
XQ2d	GCTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC
HG9⁃5	GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTTAT
HG9⁃10	GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTTATGATAA
HG9⁃15	GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTTATGATAATTAGG
HG9⁃20	GGATAGGGATTCTGTTGGTCGGCTGGTTGGTATCCTTTATGATAATTAGGTTGTA
RS⁃10	ATTCTTCCTGCGCGATTCTGTTCTCTGTATATTCGTCGCTGGTTGG
XQ2d⁃tri	GCTCATAGGGTTAGGGGCTGCTGGCCAGATACTCAGATGGTAGGGTTACTATGAGC

Fig.1 Design and characterization of HG9⁃n⁃tri（A） Flow cytometry detection of MV4-11 uptake of XQ2d-FAM and HG9-FAM within 0—4 h；（B） confocal fluorescence microscopy observation of MV4-11 cell uptake of FAM-labeled XQ2d and HG9 within 0—4 h（bar=5 μm）；（C） quantitative analysis of time- dependent uptake of FAM-labeled XQ2d and HG9 by MV4-11 cells（0—4 h）；（D） WB analysis of CD71 degradation in MV-4-11 cells treated with indicated concentrations of HG9-10-tri or XQ2d-tri；（E） comparison of CD71 protein degradation efficiency by HG9-tri or XQ2d-tri；（F） WB detection of CD71 protein degradation by HG9-10-tri conjugates with different linker lengths（n=5， 10， 15， 20）；（G） comparison of CD71 protein degradation efficiency by HG9-n-tri conjugates with different linker lengths.

Fig.2 Analysis of the targeting capability of HG9⁃10⁃tri in vitro and in vivo（A） Flow cytometry detection of binding capacity of HG9-10 and HG9-10-tri at gradient concentrations to MV4-11；（B） dissociation constant fitting curves of HG9-10 and HG9-10-tri for MV4-11；（C） stability analysis of HG9-10 and HG9-10-tri in medium containing 10% FBS at 37 ℃；（D） statistical analysis of HG9-10 and HG9-10-tri stability in 10% FBS；（E） comparative in vivo imaging of targeting effects of RS-10-tri-Cy5 and HG9-10-tri-Cy5 in leukemia model mice.

Fig.3 Investigation of ASGPR⁃mediated Endocytosis of HG9⁃10⁃tri via the Clathrin⁃Mediated Pathway（A） Confocal microscopy images showing the colocalization of lysosomes with FAM-labeled HG9-10-tri or RS-10-tri in MV4-11 cells；（B） quantification of the fluorescence colocalization between lysosomes and FAM-labeled HG9-10-tri in MV4-11 cells corresponding；（C） confocal images showing colocalization of lysosomes and FAM-labeled HG9-10-tri in MV4-11 cells；（D） quantification of the fluorescence colocalization between lysosomes and FAM-labeled HG9-10-tri in MV4-11 cells（corresponding to A）；（E） WB analysis of CD71 protein degradation in MV4-11 cells treated with Chlorpromazine；（F） quantification of the gray values from the WB results showing CD71 protein degradation.

Fig.4 HG9⁃10⁃tri targets the lysosome to degrade CD71 protein（A） Confocal microscopy images of cells incubated with 2 μmol/L Fam， Rs-10-Fam， and HG9-10-tri-Fam for 2 h； the nuclei were stained with Hoechst （blue）， lysosomes were stained with a specific dye（red）， internalized HG9-10-tri-Fam appears green， and merged regions are shown in yellow（scale bar： 5 μm）；（B） statistical analysis of the colocalization between lysosomes and HG9-10-tri-FAM captured by confocal microscopy；（C） WB analysis of CD71 protein degradation；（D） concentration-dependent degradation of CD71 protein by HG9-10-tri and corresponding grayscale value statistics；（E） time-dependent degradation of CD71 protein and corresponding grayscale value statistics；（F） statistical analysis of CD71 degradation in MV4-11 cells treated with various protein inhibitors；（G） quantitative analysis of CD71 degradation in MV4-11 cells treated with increasing concentrations of HG9-10-tri；（H） quantitative analysis of CD71 degradation in MV4-11 cells treated with 5 μmol/L HG9-10-tri for the indicated time periods.

Fig.5 Effects of HG9⁃10⁃tri on apoptosis and cell cycle in MV4⁃11 cells（A） CCK-8 assay results of HG9-10-tri cytotoxicity on MV4-11 cells（IC50 of HG9-10-tri=2458 nmol/L， IC50 of HG9-10=9898 nmol/L）；（B） live/dead cell staining；（C） apoptosis of MV4-11 cells induced by HG9-10-tri（72 h treatment）；（D） quantitative analysis of apoptosis in MV4-11 cells treated with HG9-10-tri；（E） cell cycle distribution of MV4-11 cells after 72 h treatment with HG9-10-tri（flow cytometry analysis and quantitative statistics）；（F） quantitative analysis of cell cycle distribution in MV4-11 cells treated with HG9-10-tri.

参考文献 30

[1]	Wolska⁃Washer A.， Smolewski P.， Cancers， 2022， 14（15）， 3778
[2]	Rehman M. U.， Wu X. X.， Chen Q. ， Liu Z. W.， Long S. H.， Bioorg. Chem.， 2025， 167， 109249
[3]	Yi W. W.， Zhang J. H.， Huang Y. X.， Zhan Q.， Zou M.， Cheng X.， Zhang X. G.， Yin Z. N.， Tao S.， Cheng H.， Wang F. D.， Guo J.， Ju Z. Y.， Chen Z. Y.， Leukemia， 2024， 38（5）， 1003—1018
[4]	Wang F.， Lv H. H.， Zhao B.， Zhou L. F.， Wang S. H.， Luo J.， Liu J. Y.， Shang P.， J. Exp. Clin. Canc. Res.， 2019， 38（1）， 406
[5]	Liu Y.， Liu Y.， Tong Y.， Pharm. Inf.， 2020， 9（3）， 92—102
	刘洋，刘煜，童玥. 药物资讯， 2020， 9（3）， 92—102
[6]	Zhen Y. Z.， Chen Y. X.， Hu J. D.， J. Leuk. Lymphoma， 2022， 31（7）， 441—444
	郑湧智，陈艳欣，胡建达. 白血病·淋巴瘤， 2022， 31（7）， 441—444
[7]	Wei Y. Y.， Zhang X. Z.， Zhang F.， Li Z. B.， Wang N. N.， Liu S.， Yue B. H.， J. Exp. Hematol.， 2015， 23（1）， 234—240
	魏园玉，张晓飐，张帆，李曌博，王宁宁，刘帅，岳保红. 中国实验血液学杂志， 2015， 23（1）， 234—240
[8]	Płoszyńska A.， Ruckemann⁃Dziurdzińska K.， Jóźwik A.， Mikosik A.， Lisowska K.， Balcerska A.， Witkowski J. M.， Folia Histochem. Cyto.， 2012， 50 （2）， 304—311
[9]	Lopes M.， Duarte T. L.， Teles M. J.， Mosteo L.， Chacim S.， Aguiar E.， Pereira⁃Reis J.， Oliveira M.， Silva A. M. N.， Gonçalves N.， Martins G.， Kong I. Y.， Zethoven M.， Vervoort S. J.， Martins S.， Quintela M.， Hawkins E. D.， Trigo F.， Guimarães J. T.， Mariz J. M.， Porto G.， Duarte D.， Blood adv.， 2021， 5（16）， 3102—3112
[10]	Bordini J.， Galvan S.， Ponzoni M.， Bertilaccio M. T. S.， Chesi M.， Bergsagel P. L.， Camaschella C.， Campanella A.， Leukemia， 2017， 31（4）， 967—970
[11]	Grignano E.， Birsen R.， Chapuis N.， Bouscary D.， Front. Oncol.， 2020， 10， 586530
[12]	Rodríguez J. A.， Luria⁃Pérez R.， López⁃Valdés H. E.， Casero D.， Daniels T. R.， Patel S.， Avila D.， Leuchter R.， So S.， Ortiz⁃Sánchez E.， Bonavida B.， Martínez⁃Maza. O.， Charles A. C.， Pellegrini M.， Helguera G.， Penichet M. L.， Leukemia Lymphoma， 2011， 52（11）， 2169—2178
[13]	Voss K.， Sewell A. E.， Krystofiak E. S.， Gibson⁃Corley K. N.， Young A. C.， Basham J. H.， Sugiura A.， Arner E. N.， Beavers W. N.， Kunkle D. E.， Dickson M. E.， Needle G. A.， Skaar E. P.， Rathmell W. K.， Ormseth M. J.， Major A. S.， Rathmell J. C.， Sci. Immunol.， 2023， 8（79）， eabq0178
[14]	Garciaz S.， Bories， P.， Boher J. M.， Hospital M. A.， Récher C.， Saillard C.， Hicheri Y.， Belanger C.， Monteiro R.， Hermine O.， Launay P.， Vey N.， Blood， 2023， 142（Supplement1）， 4290
[15]	Venkatesan J.， Murugan D.， Lakshminarayanan K.， Smith A. R.， Thirumalaiswamy H. V.， Kandhasamy H.， Zender B.， Zheng G. R.， Rangasamy L.， Pharmacol. Ther.， 2024， 263， 108725
[16]	Chen X. H.， Ji M. M.， Bai X. ， Zhang T. L.， Li X. ， Wang Y. R.， Li W. ， Geng H. M.， Li X. ， Lu J. ， Tang J. L.， Liu K. D.， Yuan B. Y.， Li Z. H.， Chem. Eng. J.， 2025， 511， 161974
[17]	Li Y. Q.， Liu X. L.， Yu L.， Huang X.， Wang X.， Han D.， Yang Y.， Liu Z.， J. Am. Chem. Soc.， 2023， 145（45）， 24506—24521
[18]	Wu Y. Q.， Lin， B. Q.， Lu Y. Z.， Li L. ， Deng K. Y.， Zhang S. H.， Zhang H. M.， Yang C. Y.， Zhu Z.， Angew. Chem. Int. Ed.， 2023， 62（15）， e202218106
[19]	Huang Q.， Liu X.， Zhang P. G.， Wu Z.， Zhao Z. L.， Chem. Res. Chinese Universities， 2022， 38（4）， 928—934
[20]	Huang B. W.， Abedi M.， Ahn G.， Coventry B.， Sappington I.， Tang C.， Wang R.， Schlichthaerle T.， Zhang J. Z.， Wang Y. J.， Goreshnik I.， Chiu C. W.， Chazin⁃Gray A.， Chan S.， Gerben S.， Murray A.， Wang S. Z.， O’Neill J.， Yi L.， Yeh R.， Misquith A.， Wolf A.， Tomasovic L. M.， Piraner D. I.， Gonzales M. J. D.， Bennett N. R.， Venkatesh P.， Ahlrichs M.， Dobbins C.， Yang W.， Wang X. R.， Sahtoe D. D.， Vafeados D.， Mout R.， Shivaei S.， Cao L. X.， Carter L.， Stewart L.， Spangler J. B.， Roybal K. T.， Greisen P. J.， Li X. C.， Bernardes G. J. L.， Bertozzi C. R.， Baker D.， Nature， 2025， 638（8051）， 796—804
[21]	Liu J. H.， Chen Y. M.， Cai X. Q.， Acta Pharm. Sin.， 2022， 57（2）， 313—320
	刘京虹，陈怡敏，蔡晓青. 药学学报， 2022， 57（2）， 313—320
[22]	Kougentakis C.， Shurtleff M. J.， Lieser R. M.， Chen T.， Collins C. L.， Johnson I. E.， Gu S. Y.， Akama K. T.， Doran K. H.， Fung C. K.， Hildebrandt D. J.， Khaleghi R.， Li D.， Rank S.， Tran T. T.， Yau R.， Holly R. W.， Langsdorf C.， Lindhout D. A.， McWhirter S. M.， Iwig J. S.， Lewis J. G.， Staben S. T.， Turtle E. D.， Lind N. A.， bioRxiv， 2025， doi： http： //doi.org/10.1101/2025.01.12.632472
[23]	Wang X. M.， Zhang C. L.， Chen Y. Z.， Chin. J. Hosp. Pharm.， 2023， 43（10）， 1170—1175
	王熙敏，张程亮，陈云舟. 中国医院药学杂志， 2023， 43（10）， 1170—1175
[24]	Zhang N.， Bing T.， Shen L. Y.， Feng L.， Liu X. J.， Shangguan D. H.， Int. J. Mol. Sci.， 2021， 22（16）， 8923
[25]	Zhang N.， Wang J. Y.， Bing T.， Liu X. J.， Shangguan D. H.， Mol. Ther.⁃Nucl. Acids， 2022， 27， 1249—1259
[26]	Owen C.， Fader K. A.， Hassanein M.， Bioanalysis， 2024， 16（5）， 319—328
[27]	Zhou X.， Mol. Cancer Ther.， 2024， 23（12_Supplement）， IA017
[28]	Wu X. Q.， Zhao Z. L.， Bai H. R.， Fu T.， Yang C.， Hu X. X.， Liu Q. L.， Champanhac C.， Teng I. T.， Ye M.， Tan W. H.， Theranostics， 2015， 5（9）， 985—994
[29]	Liu J.， Liu X. J.， Yi M. W.， Sun Y.， Bing T.， Zhang N.， Shangguan D. H.， Chem. Commun.， 2022， 58（77）， 10797—10800
[30]	Chen J. L.， Wang J. Q.， Sui B. L.， Jiang P. W.， Wang X. M.， Wang H. D.， Liang F.， JACS Au， 2025， 5（5）， 2246—2256