基于链替代信号放大灵敏检测端粒酶活性的电化学方法

doi:10.7503/cjcu20200435

摘要/Abstract

摘要：

利用标记二茂铁基团的DNA(T-DNA)分子作为信号探针, 基于端粒酶特异性延长其底物链(TS)所引发的链替代反应, 建立了一种检测端粒酶活性的电化学信号放大法. 将巯基化的发夹型DNA分子(H-DNA)通过金-硫键自组装于金电极表面, 辅助DNA(A-DNA)与二茂铁修饰的T-DNA部分互补杂交形成双链AT-DNA; 当端粒酶存在时, 可在TS的3′末端合成TTAGGG的重复序列; A-DNA与TS延长链杂交置换出T-DNA; T-DNA与发夹H-DNA杂交使得二茂铁靠近电极表面; 一条TS延长链可以释放出多条T-DNA, 将二茂铁富集到金电极表面, 从而实现信号放大检测端粒酶活性. HeLa细胞个数在5~100范围内与电流值成正比, 最低可检测5个HeLa细胞中端粒酶的活性. 因此，本文建立了一种简单灵敏检测端粒酶活性的电化学方法.

关键词: 端粒酶, 链替代反应, 电化学

Abstract:

An electrochemical method was developed for sensitive detection of telomerase activity based on strand displacement reaction. A ferrocene（Fc）-labeled DNA probe（T-DNA） was designed as signal probe. The thiolated hairpin DNA（H-DNA） was used as capture probe and was self-assembled on the Au electrode surface via Au-S bond. Assisted DNA（A-DNA） partially hybridized with T-DNA to form AT-DNA duplex. In the presence of telomerase， telomerase substrate（TS） primer was elongated by adding multiple TTAGGG repeats at its 3′ terminal. The elongated DNA hybridized with A-DNA to displace T-DNA which can hybridize with H-DNA. As a result， the Fc tags are close to the Au electrode surface， producing an electrochemical signal. One elongated DNA can displace multiple T-DNAs， leading to the enrichment of Fc onto the Au electrode for signal amplification. Based on this， the peak current is linearly related with the number of HeLa cells in the range of 5―100 cells， and detection limit is down to 5 HeLa cells. Therefore， it provides a simple and sensitive approach for detecting telomerase activity.

Key words: Telomerase, Strand displacement reaction, Electrochemistry

中图分类号:

O657.1

马艳蓉, 江胜男, 金燕. 基于链替代信号放大灵敏检测端粒酶活性的电化学方法[J]. 高等学校化学学报, doi: 10.7503/cjcu20200435.

MA Yanrong, JIANG Shengnan, JIN Yan. Sensitive and Electrochemical Detection of Telomerase Activity Based on the Signal Amplification of Strand Displacement Reaction[J]. Chemical Journal of Chinese Universities, doi: 10.7503/cjcu20200435.

图/表 8

Table 1 Sequences of DNA probes

Name	Sequence(5′?3′)
A?DNA	CATCACCCTAACCCTAACTCTGCTG
T?DNA	ATGGTTTAGGGTTAGGGTGATG
H?DNA	SH?CATCACCCTAACCCTAAACCATGTGTAGATTTAGGGTTAGGGT
ACX	GCGCGGCTTACCCTTACCCTTACCCTAACC
TS	AATCCGTCGAGCAGAGTT

Scheme 1 Schematic diagram of the electrochemical detection of telomerase activity

Fig.1 Verification of telomerase activity(A) and strand displacement reaction(B) by polyacrylamide gel electrophoresisThe concentrations of DNAs are 200 nmol/L.

Fig.2 Proof?of?principle by DPV and CV(A) DPV peak current of MCH/H?DNA/Au electrode under different conditions. Reference and Auxiliary electrode is Ag/AgCl and Pt electrode, respectively. a. Lysis buffer; b. inactive telomerase; c. cell extract of HL?7702 cell; d. telomerase. (B) CV curves of Au electrode under different conditions in 5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6 solution at a scan rate of 100 mV/s. a. Bare Au electrode; b. MCH/H?DNA/Au electrode; c. b+inactive telomerase; d. b+telomerase.

Fig.3 Electrochemical impedance spectroscopy of Au electrode under different conditions in 0.1 mol/L KCl aqueous solution containing 5 mmol/L K3Fe(CN)6/K4Fe(CN)6Inset shows the electrochemical impedance spectroscopy of bare Au electrode.

Fig.4 Effect of H?DNA concentration(A) and T?DNA concentration(B) on the peak currentThe concentrations of H?DNA and T?DNA are 0.1, 0.5, 1.0, 5.0 and 10.0 μmol/L, respectively.

Fig.5 Effects of SDR reaction time(A) and hybridization time(B) on the DPV peak current

Fig.6 DPV peak current plotted against the number of HeLa cellsThe numbers of HeLa cells are 5, 10, 20, 50, 80 and 100, respectively.

参考文献 25

1	Yu G. L.， Bradley J. D.， Attardi L. D.， Blackbum E. H.， Nature， 1990， 344， 126―132
2	Hiyama E.， Yokoyama T.， Tatsumoto N.， Hiyama K.， Imamura Y.， Murakami Y.， Kodama T.， Piatyszek M. A.， Shay J. W.， Mastsuura Y.， Cancer Res.， 1995， 55， 3258―3262
3	Hiyama E.， Gollahon L.， Kataoka T.， Kuroi K.， Yokohama T.， Gazder A. F.， Hiyama K.， Piatyszek M. A.， Shay J. W.， J. Natl. Cancer Inst.， 1996， 88， 116―122
4	Sommerfeld H. J.， Meeker A. K.， Piatyszek M. A.， Bova G. S.， Shay J. W.， Coffey D. S.， Cancer Res.， 1996， 56， 218―222
5	Lin Y.， Miyamoto H.， Fujinami K.， Uemura H.， Hosaka M.， Iwasaki Y.， Kubota Y.， Clin.Cancer Res.， 1996， 2， 929―932
6	Chadeneau C.， Hay K.， Hirte H. W.， Gallinger S.， Bacchetti S.， Cancer Res.， 1995， 55， 2533―2563
7	Cohen S. B.， Graham M. E.， Lovrecz G. O.， Bache N.， Robinson P. J.， Reddel R. R.， Science， 2007， 315， 1850―1853
8	Kim N. W.， Piatyszek M. A， Prowse K. R.， Harley C. B.， West M. D.， Hop. L.， Coviello G. M.， Science， 1994， 266， 2011―2015
9	Tian L.， Weizmann Y.， J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135， 1661―1664
10	Zhang X. F.， Cheng R.， Shi Z. L.， Jin Y.， Chem. J. Chinese Universities，2016， 37（1）， 12―18（张霞菲，成锐，时志路，金燕. 高等学校化学学报， 2016， 37（1）， 12―18）
11	Gao Y. F.， Xu J.， Li B. X.， Jin Y.， Biosens. Bioelectron.， 2016， 84， 415―422
12	Zhang X.， Cheng R.， Shi Z. L.， Jin Y.， Biosens. Bioelectron.， 2016， 75， 101―107
13	Duan R.， Wang B.， Zhang T.， Zhang Z.， Xu S.， Chen Z.， Lou X.， Xia F.， Anal. Chem.， 2014， 86， 9781―9785
14	Sharon E.， Golub E.， Niazov⁃Elkan A.， Balogh D.， Willner I.， Anal. Chem.， 2014， 86， 3153―3158
15	Wang L. J.， Zhang Y.， Zhang C. Y.， Anal. Chem.， 2013， 85， 11509―11517
16	Li Y.， Li X.， Li X. T.， Li X. M.， Biosens. Bioelectron.， 2011， 26， 4095―4098
17	Liu X. J.， Li W.， Hou T.， Dong S. S.， Yu G. H.， Li F.， Anal. Chem.， 2015， 87， 4030―4036
18	Zhang H. R.， Wu M. S.， Xu J. J.， Chen H. Y.， Anal. Chem.， 2014， 86， 3834―3840
19	Shao Z. Y.， Liu Y.， Xiao H.， Li G. X.， Electrochem．Commun.， 2008， 10（10）， 1502―1504
20	Wang G. W.， Wang H.， Cao S.， Xiang W.， Li T.， Yang M. H.， Microchim. Acta， 2019， 186（2）， 96
21	Liu X. J.， Li W.， Hou T.， Dong S. S.， Yu G. H.， Li F.， Anal. Chem.， 2015， 87（7）， 4030―4036
22	Liu Y. J.， Wei M.， Liu X.， Wei W.， Zhao H. Y.， Zhang Y. J.， Liu S. Q.， Chem. Commun.， 2016， 52（9）， 1796―1799
23	Dong F.， Zhu L. Y.， Huang J.， Ren J. J.， Lei J. P.， Biosen. Bioelectron.， 2019， 138， 111313.
24	Wang L.， Meng T. J.， Yu G. S.， Wu S. S.， Sun J. J.， Jia H. X.， Wang H.， Yang X. J.， Zhang Y. F.， Biosen. Bioelectron.， 2019， 124/125， 53―58
25	Li Y.， Liu B. W.， Li X.， Wei Q. L， Biosens. Bioelectron.， 2010， 25， 2543―2547

[1]	姬少博, 陈晓东. 柔性电子学中的表界面化学[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(Album-4): 1-19.
[2]	廖妮, 张捷源, 黄梓阳, 赵晏汐, 柴雅琴, 袁若, 卓颖. 共晶诱导增强的电化学发光9,10-二苯基蒽-苝微晶构建高效尿酸传感器[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(9): 1989-1995.
[3]	曹芷源, 孙慧, 苏彬. 量子点电化学发光研究进展及展望[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(9): 1945-1955.
[4]	项厚政, 谢鸿翔, 李文超, 刘晓磊, 冒爱琴, 俞海云. 尖晶石型高熵氧化物的制备和电化学性能[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(8): 1801-1809.
[5]	白延群,王存国,李雪,樊文琪,宋鹏豪,顾圆春,刘法谦,刘光烨. 孔道有序排列高容量S@C复合电极材料的制备及电化学性能[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(6): 1306-1312.
[6]	毛庆,赵健,刘松,郭唱,李冰玉,徐可一,曹自强,黄延强. Ni单原子催化剂表面CO₂电还原动力学的电化学谱学解析[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(5): 1058-1067.
[7]	韩俊甜,崔耀星,苏志俊,武奕,陈留平,徐俊辉. 应用于水相有机液流电池的双电子紫精化合物[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(5): 1035-1041.
[8]	刘璐,伍含月,李静,佘岚. 铁镍合金催化剂的结构调控及对电化学析氧反应的催化性能[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(5): 1083-1090.
[9]	韩方杰, 代梦娇, 梁芷珊, 宋忠乾, 韩冬雪, 牛利. 光电化学技术应用于抗氧化分析的研究进展[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(4): 591-603.
[10]	付可飞, 连惠婷, 魏晓峰, 孙向英, 刘斌. 环糊精基阻抗型传感器的制备及对L-半胱氨酸的识别[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(4): 706-715.
[11]	张晶晶, 金融, 方丹君, 江德臣. 电压调制型高灵敏电化学发光分析[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(11): 2421-2425.
[12]	滕渝,杨绍明,柏朝朋,张剑. 基于多壁碳纳米管增敏材料的辣根过氧化物酶分子印迹电化学传感器的制备及对H₂O₂的检测[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(1): 78-86.
[13]	邓安强,罗永春,夏元华,彭思慧,马伟旗,赵旭东,杨洋,侯晓东. 退火处理对新型无镁Y_0.7La_0.3Ni_3.25Al_0.1Mn_0.15储氢合金结构和电化学性能的影响[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(1): 145-154.
[14]	李勃天,邵伟,肖达,周雪,董俊伟,唐黎明. 聚吡咯纳米线凝胶的模板制备及储能与电化学传感性能[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(1): 183-190.
[15]	范慧, 金葆康. 醌类衍生物捕获CO₂的红外光谱电化学研究[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(9): 1847-1856.