丝胶蛋白源Tn和T抗原的释放制备及质谱分析

doi:10.7503/cjcu20230378

摘要/Abstract

摘要：

以蚕茧丝胶蛋白源Tn抗原和T抗原为研究对象, 采用“一釜法”、氨水催化法和链霉蛋白酶E(Pronase E)水解法对丝胶蛋白O-糖链进行释放, 并通过固相萃取柱进行分级纯化, 以高效液相色谱仪(HPLC)进行分离制备; 利用电喷雾质谱(ESI-MS)、串联质谱(MS/MS)及在线液相色谱-质谱联用仪(Online LC-MS)进行了结构鉴定和定量分析. 结果表明, 丝胶蛋白中O-GalNAc含量为1.58 μg/g, O-GalNAcGal含量为0.54 μg/g, 二者丰度比约为5.3∶1; 并且氨水可高效释放出其还原性O-连接单糖GalNAc, 通过液相色谱法可实现其精细分离纯化, 而以等量Pronase E对丝胶蛋白水解可有效释放出Tn抗原和T抗原.

关键词: Tn和T抗原, 丝胶蛋白, O-糖链释放, 高效液相色谱, 质谱

Abstract:

Silkworm sericin-derived Tn and T antigens， a group of biomarkers of many cancers， were targeted in this study. The O-glycans of sericin were first released using the “one-pot” non-reductive release method， the ammonia-catalyzed non-reductive release strategy and the pronase E digestion approach. The samples were subsequently fractionated for purification using solid-phase extraction columns and separated for preparation via high-performance liquid chromatography（HPLC）. The generated glycan samples were finally analyzed in detail by means of electrospray ionization mass spectrometry（ESI-MS）， tandem mass spectrometry（MS/MS） and liquid chromatography coupling online with mass spectrometry（Online LC-MS）. The obtained results showed that the O-glycans of sericin just include O-GalNAc and O-GalNAcGal， the contents of which have been determined to be 1.58 μg/g and 0.54 μg/g， respectively. Their molar ratio in sericin is approximately 5.3∶1. The O-linked monosaccharide of sericin， GalNAc， allows efficient non-reductive release as a reducing form in ammonium hydroxide and fine separation by liquid chromatography. Tn and T antigens can be efficiently generated from sericin using pronase E with an amount equal to the raw glycoprotein.

Key words: Tn and T antigens, Sericin, O-Glycan release, High-performance liquid chromatography, Mass spectrometry

中图分类号:

O629.1

TrendMD:

满丽娟, 叶佳佳, 张德锋, 邹籽华, 黄琳娟, 王仲孚, 王承健. 丝胶蛋白源Tn和T抗原的释放制备及质谱分析. 高等学校化学学报, 2023, 44(12): 20230378.

MAN Lijuan, YE Jiajia, ZHANG Defeng, ZOU Zihua, HUANG Linjuan, WANG Zhongfu, WANG Chengjian. Preparative Release and Mass Spectrometric Analysis of Tn and T Antigens Existing in Sericin. Chem. J. Chinese Universities, 2023, 44(12): 20230378.

图/表 4

Fig.1 Structural identification and quantification of intact O⁃glycans as PMP derivatives released from sericin by ESI⁃MS, MS/MS, RP⁃HPLC and LC⁃MS（A） ESI-MS profile of PMP-labelled O-glycans released from sericin；（B） MS n analysis of permethylated H1N1-2PMP derived from sericin；（C） RP-HPLC profiles of PMP-labelled O-glycans released from sericin；（D） extracted ion chromatogram（EIC） of H1-2PMP released from sericin. Structural formulas： H， hexose； N， N-acetylhexosamine； blue square， N-acetylglucosamine； yellow square， N-acetylgalactosamine.

Fig.2 Reaction condition optimization and product chromatographic separation of the ammonia⁃catalyzed method for non⁃reductive release of sericin O⁃linked monosaccharide（A， B） MS peak intensity curves of GalNAc released from sericin at different reaction temperatures and times， respectively； n=3；（C， D） MS profiles of sericin O-glycan samples before and after BSH labeling， respectively；（E） HILIC profile of sericin O-glycans as BSH derivatives；（F） MS profile of the glycan sample recovered from detagging reactions of HILIC-separated sericin O-glycan fractions as BSH derivatives. The asterisk denotes unknown impurities.

Fig.3 ESI⁃MS profiles of Tn antigen(A) and T antigen(B) derived from sericinStructural formulas： yellow circle， galactose； Ser， serine； Thr， threonine. The asterisk denotes unknown impurities.

Fig.4 MS/MS analysis of Tn antigen and T antigen derived from sericin（A—D） MS/MS profiles of GalNAc-Ser， GalNAc-Thr， GalGalNAc-Ser and GalGalNAc-Thr derived from sericin， respectively.

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