自由能计算揭示苏氨酸对抗冻蛋白与冰晶结合能力的影响

doi:10.7503/cjcu20210838

摘要/Abstract

摘要：

采用分子动力学模拟和自由能计算研究了中等活性黑麦草抗冻蛋白(Lolium perenne antifreeze protein, LpAFP)冰结合位点(Ice-binding site, IBS)上苏氨酸(Thr)含量对其吸附冰晶能力的影响. 构建了一系列LpAFP突变体结构, 使其IBS上苏氨酸含量逐步增加, 其中包括一个对IBS上11个位点的突变, 使每个β片段均具有Thr-x-Thr基序(x是非保守的氨基酸, 主要是疏水氨基酸). 利用重要性采样算法(WTM-eABF)计算了LpAFP及其突变体与冰晶结合过程的自由能变化, 该算法结合了Well-tempering metadynamics的“填谷”和扩展拉格朗日自适应偏置力方法的“削峰”的优点, 显著提高了算法的采样效率. 结果表明, LpAFP突变体的IBS苏氨酸含量越高, 其与冰的结合在能量上越有利. 当突变体具有重复Thr-x-Thr基序时, 其与冰的结合能力最强. 进一步分析表明, 苏氨酸含量越高, IBS结合的液态水分子越多, 与冰晶结合时锚定包合水稳定存在的时间就越长, 抗冻蛋白的IBS与冰面之间的氢键网络也越稳定, 从而提高了抗冻蛋白与冰的结合能力. 增加苏氨酸残基的含量是提高中等活性抗冻蛋白抗冻活性的方法.

关键词: 抗冻蛋白, 自由能计算, 冰晶, 结合亲和力, 氢键

Abstract:

The effect of the threonine content at the ice-binding site（IBS） of moderately active Lolium perenne antifreeze protein（LpAFP） on its binding ability to ice crystals was investigated， employing molecular dynamics simulations and free-energy calculations. A series of mutants of LpAFP were constructed by gradually increasing the amount of threonine on the IBS， including a mutation of eleven sites to make each β-strand have a Thr-x-Thr motif（x is a nonconserved amino acid， mostly a hydrophobic residue）. An importance-sampling algorithm， WTM-eABF， was used to explore the free-energy profile characterizing the adsorption process for LpAFP and its different mutants. WTM-eABF merges the key features of well-tempered metadynamics?“flooding valleys” and an extended Lagrangian variant of adaptive biasing force?“shaving barriers”（WTM-eABF）， which greatly improves the sampling efficiency of the algorithm. The free-energy calculation results indicate that the higher the threonine content of the IBS， the energetically more favorable for binding of AFPs to ice crystals. The mutant with a repeating sequence Thr-x-Thr motif on its flat β-sheet region has the strongest binding affinity to ice. Further analysis showed that the higher the content of threonine， the more ordered water molecules around the IBS， the longer the existence of the anchored clathrate water， and the more stable hydrogen bond network between the IBS and ice surface， thus improving the association strength of AFPs with ice. Overall， increasing the content of threonine residues could significantly enhance the binding ability to ice， which constitutes an approach to improve the antifreeze activity of antifreeze proteins with moderate activity.

Key words: Antifreeze protein, Free-energy calculation, Ice crystal, Binding affinity, Hydrogen bond

中图分类号:

O641

TrendMD:

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图/表 6

Fig.1 Schematic representation of TmAFP(PDB ID: 1EZG) aligned to the basal plane of ice(A), crystal structures of TmAFP and LpAFP(PDB ID: 3ULT)(B)(A) Red spheres indicate oxygen atoms in the ice lattice and within the hydroxyl groups of threonine. Horizontal dotted red lines highlight the near?perfect two?dimensional match of the interstrand threonine residues to the basal plane. Vertical dotted red lines highlight the match of the intrastrand threonine residues to a section of the basal plane. (B) TmAFP and LpAFP, with 0.48 nm between adjacent β?strands and 0.70 and 0.68 nm, between residues separated by two positions on the same β?strand, respectively. AFP backbones and IBSs are shown in cartoon and stick representations, respectively. The front view is the ice?binding face of the AFPs.

Table 1 Details of the molecular assemblies investigated in this study

Molecular assembly	Number of atom	Box/nm³	Simulation time/ns
LpAFP	57223	7.1×8.8×7.3	400
Mutant1 ^a	52610	7.1×8.1×7.3	400
Mutant2 ^b	52578	7.1×8.1×7.3	400
Mutant3 ^c	52545	7.1×8.1×7.3	400
Mutant4 ^d	52516	7.1×8.1×7.3	400

Fig.2 LpAFP/mutant?ice?water assemblies for MD(A), schematic diagram of the a?axis of ice(B) and LpAFP/mutant?ice?water assemblies for free?energy calculations(C)AFP backbones are shown in cartoon. (A) The distance between the IBS and the basal plane of ice crystals is 1.0 nm. (C) d denotes the projection along the y direction of Cartesian space of the vector connecting the center of mass of the oxygen atoms of the ice and that of the AFP.

Fig.3 Radial distribution function of water(oxygen atoms) around the IBS of LpAFP and its mutants obtained from MD simulations(A), hydrogen bond lifetime correlation functions between any water molecules and amino acid residues at the IBS for wild?type LpAFP and its mutants adsorbed on ice crystals(B)

Fig.4 Free?energy profiles characterizing the adsorption process for LpAFP, Mutant 2 and Mutant 4(A), free?energy profiles at different simulation times for the LpAFP(B), Mutant 2(C) and Mutant 4(D)Inset of (A): water molecules around threonine form water cages. The results show that the calculations have converged within 800 ns.

Fig.5 Hydrogen bond structures of water molecules within 0.5 nm below the IBS of LpAFP(A), Mutant 2(B) andMutant 4(C) adsorbed on ice crystalsCW is shown in vdW representation(oxygen atoms shown in yellow).

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