硒唑甲酰胺类Src激酶抑制剂对阿尔茨海默病中A β 诱导的毒性作用

doi:10.7503/cjcu20260241

摘要/Abstract

摘要：

研究了Src酪氨酸蛋白激酶抑制剂(SAFA320)对转基因秀丽隐杆线虫CL4176的神经保护作用及其机制. 结果表明, 与空白对照相比, SAFA320处理显著减少了CL4176线虫中β淀粉样蛋白(Aβ)寡聚体的沉积, 降低了线虫的瘫痪率, 并能有效降低其体内活性氧(ROS)的产生, CL4176线虫组织内Src激酶活性也显著降低. 荧光实时定量聚合酶链式反应（PCR）结果显示, SAFA320处理会导致CL4176线虫体内skn-1基因及其下游靶基因gst-4的表达显著上调, 说明化合物SAFA320通过调节CL4176线虫中的SKN-1信号通路从而达到抑制Aβ毒性的效果. 综上所述, SAFA320在缓解CL4176线虫的Aβ毒性和改善认知功能方面具有显著效果, 是一种潜在的抗阿尔茨海默病(AD)候选药物.

关键词: 阿尔茨海默病（AD）, Src激酶抑制剂(SAFA320), β淀粉样蛋白, 基因skn-1, 秀丽隐杆线虫

Abstract:

The study was designed to investigate the effects of Src tyrosine protein kinase inhibitor（SAFA320） on transgenic Caenorhabditis elegans strainCL4176， along with its underlying mechanism. In the study， C. elegans CL4176 adminstrated with SAFA320 could reduce the deposition of Aβ oligomer to alleviate nematode paralysis， and decrease ROS production. Results of tissue Src kinase activity spectrophotometry analysis showed that SAFA320 could reduce the activities of Src in C. elegans. Meanwhile， the gene expression of skn-1 and its downstream target gene gst-4 were significantly increased， suggesting that compound inhibited Aβ toxicity may involve in SKN-1 signaling pathway in CL4176. In conclusion， SAFA320 is effective in alleviating Aβ toxicity and improving cognitive functions in C. elegans CL4176， and it is a potent candidate agent against Alzheimer’s Disease（AD）.

Key words: Alzheimer’s disease（AD）, Src inhibitor（SAFA320）, Amyloid beta, Gene skn-1, Caenorhabditis elegans

中图分类号:

O626.2

TrendMD:

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图/表 11

Table 1 Gene specific primers used in qPCR

Gene	Primer	Gene	Primer
act⁃1	Forward： 5′⁃TCCCATCCATTGTCGGAAGAC⁃3′	hsf⁃1	Forward： 5′⁃GGAGCCAATGAGCAAAAGCC⁃3′
	Reverse： 5′⁃CCAGATCTTCTTCTCCATATCATCCCAG⁃3′		Reverse： 5′⁃CCATTCTTGCTCCAGCTCCAG⁃3′
Aβ	Forward： 5′⁃CCGACATGACTCAGGATATGAAGT⁃3′	nipi⁃4	Forward： 5′⁃GACCCCGTATGCAACAGTC⁃3′
	Reverse： 5′⁃CACCATGAGTCCAATGATTGCA⁃3′		Reverse： 5′⁃CTATCCGACATTGGCTGACAG⁃3′
skn⁃1	Forward： 5′⁃CGACGAGACGAGACGATAAACG⁃3′	gst⁃4	Forward： 5′⁃GTGATGGCTGACGAAGGAAC⁃3′
	Reverse： 5′⁃GAGGTGTTGGACGATGGTGAAC⁃3′		Reverse： 5′⁃GGGAGGAAGTTATGGGCTTC⁃3′
daf⁃16	Forward： 5′⁃TTTCCGTCCCCGAACTCAA⁃3′
	Reverse： 5′⁃ATTCGCCAACCCATGATGG⁃3′

Table 2 Structure and spectra parameter of selenazole carboxamide derivative

Compound

Structural formula and chemical name

H⁃NMR（400MHz， DMSO⁃d6）， δ

MS， m/z

SAFA320

N⁃（2⁃chloro⁃6⁃methylphenyl）⁃2⁃（3⁃phenylpropanamido）⁃

1，3⁃selenazole⁃5⁃formamide

2.23（s， 3H）， 2.82（t， 2H， J=8.08 Hz）， 2.96（t， 2H， J=7.40 Hz）， 7.25（m， 7H）， 7.40（dd， 1H， J₁=1.76 Hz， J₂=7.40 Hz）， 8.30（s， 1H）， 9.95（s， 1H）， 12.69（s， 1H）

447.03

Table 3 Inhibitory activity(%) of SAFA320 against four Src kinases

Kinase	Alk	Abl	Src	Flt3
SAFA320（10 µmol/L）	0.4	71	85	17

Fig.1 Effects of SAFA320 on lifespan in C. elegans N2

Table 4 Effect of SAFA320 on lifespan of C. elegans

Group	Mean lifespan/d	Max lifespan/d	p
Control	17.74±3.704	24	—
SAFA320（100 µmol/L）	19.58±3.661	26	< 0.0001

Fig.2 Effects of SAFA320 on pharyngeal pumping in C. elegans N2The pharyngeal pumping of C. elegans was significantly raised by SAFA320. Data were analyzed by Student’s t-test using Prism 8.0. Values are presented as mean±SD， n=3. * p<0.05.a. Control； b. SAFA320.

Fig.3 Effects of SAFA320 on Egg Production in C. elegans N2（A） The daily egg production of C. elegans；（B） Overall egg production of C. elegans. a. Control； b. SAFA320. Data were analyzed by Student’s t-test using Prism 8.0. Values are presented as mean±SD， n=3. * p<0.05.

Fig.4 Effects of SAFA320 on paralysis induced by Aβ in C. elegans CL4176（A） Not paralysis rate of CL4176 at 25 ℃ on NGM containing 1， 10 or 100 µmol/L SAFA320 or control. Treatments were initiated from the first day of adulthood and were continued until death. （B） At various time points， 100 µmol/L SAFA320 delayed Aβ induced paralysis in transgenic C. elegans strain CL4176. （C） At 46 h， the paralysis phenotype of transgenic C. elegans strain CL4176 treated with or without 100 µmol/L SAFA320. Data were analyzed by Student's t-test using Prism 8.0. Values are presented as mean±SD， n=3. * p<0.05， ** p<0.01， *** p<0.001.

Fig.5 Effects of SAFA320 on Aβ plaque deposits in C. elegans CL4176（A） The effect of SAFA320 detected by thioflavin-T on Aβ deposition in the brain of CL4176 elegans. Worms were observed and photographed using a fluorescent microscope；（B） the images were analyzed with ImageJ software；（C） mRNA expression of Aβ in C. elegans. Data were analyzed by Student’s t-test using Prism 8.0. Values are presented as mean±SD， n=3. ** p<0.01， N， No significance.

Fig.6 Effects of SAFA320 on ROS in C. elegans CL4176The quantification of fluorescence intensity showed that SAFA320 could decrease the level of ROS in CL4176（44 h after temperature upshift to 25 ℃）. Data were analyzed by Student’s t-test using Prism 8.0. Values are presented as mean±SD， n=3. *** p<0.001.

Fig.7 Effects of SAFA320 on gene expression in C. elegans CL4176（A） a. actin⁃1； b. skn⁃1； c. daf-16； d. hsf-1； e. nipi-4. The effect of SAFA320 on the transcription level of skn-1， daf-16， hsf-1 and nipi-4；（B） a. actin⁃1； b. skn⁃1； c. gst-4. Effect of SAFA320 on the transcription level of gst-4， a target gene downstream of skn-1. Data were analyzed by Student’s t-test using Prism 8.0. Values are presented as mean±SD， n=3. ** p<0.01， *** p<0.001.

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