石墨烯量子点荧光探针对碱性磷酸酶活性的高效检测

doi:10.7503/cjcu20210048

摘要/Abstract

摘要：

基于苯醌类物质静态猝灭石墨烯量子点(GQDs)荧光的特性, 构建了一种利用GQDs荧光探针实时、高效检测碱性磷酸酶(ALP)活性的新方法. 过氧化氢在辣根过氧化物酶催化作用下产生羟基自由基并将邻苯二酚氧化成邻苯醌, 导致GQDs的荧光猝灭. ALP催化抗坏血酸-2-磷酸反应生成抗坏血酸, 具有较强还原性的抗坏血酸能清除溶液中的过氧化氢和羟基自由基, 抑制邻苯醌的产生, 使GQDs的荧光猝灭效果减弱. 随着ALP活性的增大, GQDs在440 nm处的荧光强度不断增强, 由此建立了一种高效检测ALP活性的新方法. 在最佳实验条件下, 该GQDs荧光探针对ALP活性的检出限为0.084 U/L. 将此方法成功用于人血清中ALP活性的检测, 为与ALP相关疾病的诊断与治疗提供了理论基础.

关键词: 石墨烯量子点, 荧光探针, 碱性磷酸酶, 静态猝灭, 酶活性

Abstract:

Based on the static fluorescence quenching effects of benzoquinones on graphene quantum dots（GQDs）， a GQDs-based fluorescent probe was established to detect the activity of alkaline phosphatase（ALP）. Under the catalytic action of horseradish peroxidase， hydrogen peroxide（H₂O₂） could generate hydro-xyl radicals（·OH）， and ·OH oxidized o-dihydroxybenzene to produce o-benzoquinone subsequently， resul-ting in the fluorescence quenching of GQDs. ALP catalyzed the production of reductive ascorbic acid by ascorbic acid 2-phosphat. Ascorbic acid efficiently removed H₂O₂ and ·OH from the solution， leading to the inhibition of the production of o-benzoquinone and the fluorescence recovery of GQDs. Therefore， a highly sensitive determination strategy for ALP activity was established. Under the optimal experimental conditions， the detection limit of ALP activity was 0.084 U/L. This method was used to evaluate ALP activity in human serum samples. Such approach can provide theoretical basis for the diagnosis and treatment of ALP-related diseases.

Key words: Graphene quantum dot, Fluorescent probe, Alkaline phosphatase, Static quenching, Enzymatic activity

中图分类号:

O657.3

TrendMD:

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图/表 16

Scheme 1 Proposed mechanism for ALP activity evaluation by GQDs

Fig.1 TEM image(A) and size distribution(B) of GQDsInset of (A) is HRTEM image of one GQDs particle.

Fig.2 FTIR spectrum of GQDs

Fig.3 UV?Vis absorption and fluorescence spectra of GQDs(A) and emission spectra of GQDs under different excitation wavelengths(B)Insets in （A） are photographs of GQDs under the irradiation of white light（left） and 365 nm UV lamp（right）.

Fig.4 Effects of irradiation time(A), NaCl concentration(B) and pH value(C) on the fluorescence intensity of GQDs

Fig.5 Fluorescence spectra of GQDs(a), GQDs/HRP(b), GQDs/o?DHB(c), GQDs/H2O2(d), GQDs/AAP(e), GQDs/ALP(f), GQDs/AA(g), GQDs/Na3VO4(h),GQDs/HRP/o?DHB(i),GQDs/HRP/H2O2/o?DHB(j), GQDs/AAP/HRP/H2O2/o?DHB(k), GQDs/ALP/AAP/HRP/H2O2/o?DHB(l) and GQDs/Na3VO4/ALP/AAP/HRP/H2O2/o?DHB(m)

Fig.6 UV?Vis absorption spectra of GQDs, H2O2/HRP/o?DHB, GQDs/H2O2/HRP/o?DHB and (GQDs/H2O2/HRP/o?DHB)?GQDs systems(A), fluorescence decay traces of GQDs and GQDs/H2O2/HRP/o?DHB system(B)Insets in （B） are fluorescence lifetimes data of GQDs(a) and GQDs in GQDs/H2O2/HRP/o-DHB system(b). τ is the fluorescent lifetime of trypsin and b is the normalized pre-exponential factor. The average fluorescence lifetime(<τ>) is calculated according to the equation of <τ> = τibi.

Fig.7 Effects of GQDs amount(A), HRP amount(B), o?DHB concentration(C), pH value(D), reaction temperature(E) and reaction time(F) on the relative fluorescence intensity of GQDs?based fluorescent probe

Fig.8 Fluorescence spectra of GQDs?based fluorescent probe with increasing concentration of H2O2(A) and relationship between relative fluorescence intensity ratio I/I0 and concentration of H2O2(B)Inset of （B） is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio I/I0 and concentration of H2O2 from 0.4 μmol/L to 100 μmol/L.

Fig.9 Fluorescence spectra of GQDs?based fluorescent probe with increasing concentration of AA(A) and relationship between relative fluorescence intensity ratio(I/I0) and concentration of AA(B)Inset of （B） is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio（I/I0） and concentration of AA from 1.0 μmol/L to 40 μmol/L.

Fig.10 Effects of pH value(A), enzymatic reaction temperature(B) and enzymatic reaction time(C) on the relative fluorescence intensity of GQDs?based fluorescent probe

Fig.11 Fluorescence spectra of GQDs?based fluorescent probe with increasing activity of ALP(A) and relationship between relative fluorescence intensity ratio(I/I0) and activity of ALP(B)Inset of （B） is the linear relationship between the relative fluorescence intensity ratio（I/I0） and activity of ALP from 0.1 to 5 U/L.

Fig.12 Effects of different enzymes on the relative fluorescence intensity of GQDs?based fluorescent probea. ALP; b. blank; c. Pep; d. TRY; e. Lys; f. Thr; g. HSA; h. BSA; i. GOx; j. AchE.

Table 1 Influences of 0.1 mmol/L co-existing substances on ALP activity evaluation

Co?existing substance	Δ（I/I₀）（%）	Co?existing substance	Δ（I/I₀）（%）
L?Aspartic acid	+1.52	Lactose	+2.74
L?Serine	-3.96	Galactose	+3.79
L?Glutamate	-4.93	Maltose	-1.13
L?Lysine	+2.36	Uric acid	-4.42
L?Phenylalanine	-2.51	Cholesterol	-0.95
D?Tryptophan	+4.18	Guanosine	+2.76
L?Tryptophan	-1.61	Adenosine	+3.59
L?Glutathione oxidized	+1.65	AlCl₃	+1.04
L?Glycine	+3.32	NiCl₂	-4.03
L?Arginine	-4.55	MnSO₄	+3.59
L?Methionine	+0.47	MgCl₂	+2.42
L?Glutamine	-1.48	CrCl₃	+1.39
L?Leucine	1.48	CdCl₂	-4.29
L?Valine	+1.36	CaCl₂	-4.56
L?α?Alanine	+4.67	NaCl	+3.80

Table 2 Evaluation of ALP activity in human serum samples

Sample	Spiked/（U·L^-1）	Found/（U·L^-1）	Recovery（%）	RSD（%）
Human serum sample 1	0	1.39—1.45	—	—
	0.5	1.90—1.92	96.5—100.4	2.62
	3	4.42—4.52	99.1—103.5	3.15
	5	6.31—6.36	97.9—98.9	0.02
Human serum sample 2	0	1.16—1.23	—	—
	0.5	1.69—1.72	98.5—102.8	0.69
	3	4.12—4.27	97.5—103.4	2.28
	5	5.98—6.12	95.5—98.4	2.03
Human serum sample 3	0	0.87—0.94	—	—
	0.5	1.39—1.42	97.9—103.7	4.09
	3	3.90—4.04	100.8—103.4	0.46
	5	5.99—6.03	101.7—102.4	0.59

Table 3 Evaluation of ALP activity with different methods and different probes

Method	Probe	Linear range/（U·L^-1）	Detection limit/ （U·L^-1）	Samples detection	Ref.
Fluorimetry	Carbon quantum dots	3.4—100	0.9	—	［35］
Electrochemical	CdS@graphene?CoOOH nanosheets	10—300	1.5	Human serum samples	［17］
Fluorimetry	Polydopamine/MnO₂ nanocomposites	1—80	0.34	Human serum samples	［20］
Fluorimetry	Hemicyanine?based near?infrared probe	10—2000	3	Cell， tissue and living animal	［36］
Colorimetric	Cu（II）?phenanthroline complex	0—200	1.25	Human serum samples	［19］
Fluorimetry	Silver nanocluster	30—3000	5	Bovine serum samples	［23］
Fluorimetry	WS₂ quantum dots	0.5—10	0.2	Human serum samples	［25］
Fluorimetry	Polydopamine nanodots	1—50	0.94	Human serum samples	［21］
Fluorimetry	Protein stabilized gold nanocubes	—	1.616	Human serum samples	［24］
Fluorimetry	Electrospun fibrous strips	0—80	1.5	Human serum samples	［37］
Fluorimetry	Carbon quantum dots	4.6—383.3	1.4	—	［26］
Fluorimetry	GQDs	0.1—5	0.084	Human serum samples	This work

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