大斯托克斯位移远红光至近红外荧光探针用于检测肝损伤过程中过氧化亚硝酸盐的动态变化

doi:10.7503/cjcu20209236

摘要/Abstract

摘要：

肝损伤是影响公众健康的重大问题之一, 已经引起了人们越来越多的关注. 而过表达的过氧化亚硝酸盐(ONOO^?)在肝损伤等疾病的发病机制中起着重要作用, 被认为是一种与早期肝损伤密切相关的生物活性分子. 因此, 为了探究ONOO^?在肝损伤过程中的作用, 开发可以实现肝损伤过程中ONOO^?高选择性和实时检测的分析方法具有重要意义. 本文报道了一种具有大斯托克斯位移的远红光至近红外(FR-NIR)ONOO^?荧光探针. 由于该探针具有大的斯托克斯位移, 可以有效消除光谱重叠和自吸收的干扰, 从而显著提高成像的信噪比. 此外, 该探针对ONOO^?具有高的灵敏度(检出限为25.8 nmol/L)和良好的选择性, 被成功用于药物诱导肝损伤过程中ONOO^?信号的成像检测.

关键词: 荧光探针, 大斯托克斯位移, 过氧化亚硝酸盐, 药物诱导肝损伤

Abstract:

Liver injury is one of the major problems affecting public health， and has attracted growing attention. It is universally believed that overexpression of peroxynitrite（ONOO^?） plays an important role in the pathogenesis of liver injury and other diseases， and it is closely related to early liver injury. Therefore， in order to understand the role of ONOO^? in the process of liver injury， an analysis method that can achieve high selectivity and real-time detection of ONOO^? is urgently developed. Herein， we present a far red to near-infrared（FR-NIR） fluorescent probe with large Stokes shift to detect the ONOO^? production in vivo during drug induced liver injury（DILI）. Owing to the large Stokes shift， the FR-NIR probe（LSDQ-ONOO^?） can not only reduce the interference of spectral overlap and self-absorption， but also improve the imaging signal-to-noise ratio. High sensitivity（detection limit=25.8 nmol/L） and excellent selectivity ensured that LSDQ-ONOO^? can monitor subtle changes of ONOO^?in vitro and in vivo during DILI.

Key words: Fluorescent probe, Large Stokes shift, Peroxynitrite, Drug induced liver injury

中图分类号:

O656

TrendMD:

吴倩, 程丹, 吕芸, 袁林, 张晓兵. 大斯托克斯位移远红光至近红外荧光探针用于检测肝损伤过程中过氧化亚硝酸盐的动态变化. 高等学校化学学报, 2020, 41(11): 2426.

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图/表 9

Fig.1 Fluorescence spectra of LSDQ?ONOO-(5 μmol/L) upon addition of ONOO- (0—6 μmol/L) in PBS/EtOH(volume ratio 8∶2, pH=7.4) buffer solutionnote：The mixture was kept for 20 min at 37 ℃ before the fluorescence intensity of the LSDQ?ONOO- solution was recorded. λex=580 nm.

Fig.2 Linear correlation between the FL intensity of LSDQ?ONOO-(5 μmol/L) and ONOO- concentration in PBS/EtOH(volume ratio 8∶2, pH=7.4) buffer solutionnote：The mixture was kept for 20 min at 37 ℃ before the fluorescence intensity of the LSDQ?ONOO- solution was recorded. λex=580 nm.

Fig.3 Absorption spectra of LSDQ?ONOO-(5 μmol/L) in the absence(a) and in the presence(b) of ONOO-(5 μmol/L) in PBS/EtOH(volume ratio 8∶2, pH=7.4) buffer solutionnote：The mixture was kept for 20 min at 37 ℃ before the absorption of the LSDQ?ONOO- solution was recorded. Inset: after reacting with ONOO?, the absorption peak of the probe shifted to 562 nm; due to the fluorescence recovery of the probe, the solution color changed from light red to dark red.

Fig.4 Fluorescence intensity of LSDQ?ONOO-(5 μmol/L) in PBS/EtOH(volume ratio 8∶2, pH=7.4) buffer solu? tion toward various analytes(100 μmol/L)note：1 mmol/L for GSH, 50 μmol/L for HOCl, 5 μmol/L for ONOO?. a. Blank; b. Cu2+; c. Fe2+; d. K+; e. Na+; f. Mg2+; g. SO42-; h. GSH; i. Cys; j. H2S; k. ·OH; l. NO2-; m. O2·-; n. H2O2; o. HOCl; p. t?BuOOH; q. ONOO-. The mixture was kept for 20 min at 37 ℃ before the fluorescence intensity of the LSDQ?ONOO- solution was recorded. λex=580 nm.

Fig.5 Distribution of LSDQ?ONOO- in HepG2 cellsnote：HepG2 cells were pretreated with LPS(1 μg/mL) and IFN?γ(50 ng/mL) for 12 h, and then incubated with 5 μmol/L LSDQ?ONOO- for 30 min and subsequently incubated with 1 μmol/L Mito?Tracker Green(or 1 μmol/L Lyso?Tracker Green) for 10 min. Green channel: Mito?Tracker Green(λex=488 nm, λem=500―550 nm) and Lyso?Tracker Green fluorescence(λex=488 nm, λem=500―550 nm); red channel: probe fluorescence(λex=561 nm, λem=640―750 nm); yellow: merged signal. (A1) Mito?tracker green; (B1) lyso?tracker green; (A2, B2) probe; (A3, B3) overlap; (A4, B4) scatter plot.

Fig.6 Fluorescent images of LSDQ?ONOO- in HepG2 cells under different conditionsnote：λex=561 nm, λem=640―750 nm. (A1―A5) Bright field; (B1―B5) red channel.(A1, B1) Cells were incubated with probe LSDQ?ONOO- (5 μmol/L, 30 min) and then imaged; (A2, B2) cells were pretreated with probe LSDQ?ONOO-(5 μmol/L, 30 min), subsequently incuba?ted with H2O2(100 μmol/L) for 30 min and then imaged; (A3, B3) cells were pre?stimulated with LPS(1 μg/mL) and IFN?γ (50 ng/mL) for 12 h, subsequently incubated with probe LSDQ?ONOO-(5 μmol/L, 30 min), and then imaged; (A4, A5, B4, B5) cells were pretreated with nitric oxide synthase inhibitor AG(5 mmol/L)(A4, B4) or O2·- scavenger TEMPO(300 μmol/L)(A5, B5) during stimulation with LPS (1 μg/mL) and IFN?γ(50 ng/mL) for 12 h, subsequently incubated with probe LSDQ?ONOO-(5 μmol/L, 30 min), and then imaged.

Fig.7 Fluorescent images of LSDQ?ONOO- in HepG2 cellsnote：(A—C) HepG2 cells were pretreated with different concentrations of APAP for 12 h and then incubated with 5 μmol/L LSDQ?ONOO- for 30 min. c(APAP)/(μmol·L?1): (A) 0; (B) 500; (C) 800. (D) Average intensity in panels(A—C). Data are expressed as mean ± standard deviation(SD) of three experiments. λex=561 nm, λem=640—750 nm.

Fig.8 Representative images of BALB/c mice receiving saline(control, A1—A3), or APAP(300 mg/kg, intraperitoneally, B1—B3) followed by LSDQ?ONOO-(50 μL, 100 μmol/L, intravenously) in 30(A1, B1), 60(A2, B2) and 90 min(A3, B3)

Fig.9 Fluorescence images of representative organs of BALB/c mice receiving saline(control, A) or APAP(300 mg/kg, intraperitoneally, B) followed by LSDQ?ONOO?(50 μL, 100 μmol/L, intravenously) after 90 minnote：Organs: 1. heart; 2. liver; 3. kidney; 4. lung; 5. spleen. λex=570 nm, λem=695―770 nm.

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