高等学校化学学报 ›› 2017, Vol. 38 ›› Issue (2): 206.doi: 10.7503/cjcu20160624
朱龙宝1, 陶玉贵1, 葛飞1, 李婉珍1, 刘义2(), 堵国成3
收稿日期:
2016-09-02
出版日期:
2017-02-10
发布日期:
2016-12-19
作者简介:
联系人简介: 刘 义, 男, 博士, 副教授, 主要从事酶工程方面的研究. E-mail: 基金资助:
ZHU Longbao1, TAO Yugui1, GE Fei1, LI Wanzhen1, LIU Yi2,*(), DU Guocheng3
Received:
2016-09-02
Online:
2017-02-10
Published:
2016-12-19
Contact:
LIU Yi
E-mail:myputer@163.com
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摘要:
克隆Streptomyces maritimus来源的苯丙氨酸变位酶(SmPAM)基因, 并进行异源表达, 制备了重组SmPAM, 用于一步合成高附加值的β-芳香丙氨酸. 提取S. maritimus的基因组, 设计1对特异性引物, 采用PCR扩增编码SmPAM的结构基因pam, 与表达载体pET28a连接, 构建重组表达质粒pET28a-pam, 转入E.coli BL21中表达, 采用亲和层析柱分离纯化重组酶SmPAM. 结果表明, 克隆得到编码523个氨基酸长度的SmPAM基因pam, 并在大肠杆菌中实现了高效表达, 制得电泳纯的重组SmPAM. 该酶在最适温度30 ℃, pH=9.0条件下活力达到2.5 U/mg, 具有较高的热稳定性和pH稳定性, 在60~70 ℃下保持3 h未见活性下降, 在pH=9~11保持24 h, 残余酶活力达到98%. SmPAM具有较宽的底物谱, 可催化苯环上携带不同基团的3-芳香丙烯酸合成β-芳香丙氨酸, 当苯环上携带吸电子基团时催化反应更易完成, 其中2-硝基-β-苯丙氨酸的产率最高, 达到93%.
中图分类号:
TrendMD:
朱龙宝, 陶玉贵, 葛飞, 李婉珍, 刘义, 堵国成. Streptomyces maritimus苯丙氨酸变位酶的制备、表征及催化合成β-芳香丙氨酸. 高等学校化学学报, 2017, 38(2): 206.
ZHU Longbao, TAO Yugui, GE Fei, LI Wanzhen, LIU Yi, DU Guocheng. Production and Characterization of Phenylalanine Aminomutase from Streptomyces Maritimus and Synthesis of β-Arylalanine†. Chem. J. Chinese Universities, 2017, 38(2): 206.
Fig.1 Agarose gel electrophoresis of gene DNA, PCR products and the digested pET28a-pamM: marker; lane 1: product of PCR; lane 2: genomeDNA; lane 3: the pET28a-pam was digested by EcoRⅠ and NdeⅠ.
Fig.2 SDS-PAGE of recombinant enzyme expressed in E.coli BL21(DE3) and purification of the recombinant SmPAM using HisTrapTM/FFM: marker; lane 1: E.coli BL21; lane 2: cell extracts of E.coli BL21/pET28a-pam without induction by IPTG; lanes 3 and 5: the supernatant fraction after sonication of E.coli BL21/pET28a-pam induced by IPTG(the arrow in lane 3 represents the expressed SmPAM); lane 4: the precipitated fraction after sonication of E.coli BL21/pET28a-pam induced by IPTG; lane 6: the purified SmPAM by HisTrap TM/Faffinity chromatography column.
Fig.6 Effects of metal ions(A) and surfactants(B) on the activity of recombinant SmPAM(A) a. Na+; b. Mg2+; c. Ca2+; d. Fe2+; e. Cu2+; f. Zn2+; g. Mn2+; h. Co3+; (B) a. CTAB; b. Triton X-100; c. Tween 80; d. SDS.
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