基于脱氧核酶的无标记端粒酶检测新方法

doi:10.7503/cjcu20141048

高等学校化学学报 ›› 2015, Vol. 36 ›› Issue (4): 625.doi: 10.7503/cjcu20141048

基于脱氧核酶的无标记端粒酶检测新方法

范宏亮^1,², 张涛²(), 金伟²(), 金钦汉²

1. 浙江省医学科学院卫生学研究所, 杭州 310013
2. 浙江大学工业控制技术国家重点实验室, 智能系统与控制研究所, 分析仪器研究中心, 杭州 310058

收稿日期:2014-11-28 出版日期:2015-04-10 发布日期:2015-03-27
作者简介:联系人简介: 张涛, 男, 博士, 副教授, 主要从事生化传感方向研究. E-mail: zhtao@zju.edu.cn. 金伟, 男, 博士, 高级工程师, 主要从事光谱分析与分析仪器研究. E-mail: jinweimy@gmail.com
基金资助:
国家自然科学基金(批准号: 21275129, 31270907)和浙江省医学科学院博士基金(批准号: 2014KYA043)资助

Novel Label-free Assay of Telomerase Based on DNAzyme^†

FAN Hongliang^1,², ZHANG Tao^2,^*(), JIN Wei^2,^*(), JIN Qinhan²

1. Department of Environmental Medicine, Institute of Hygiene, Zhejiang Academy of Medical Sciences,Hangzhou 310013, China
2. Research Center for Analytical Instrumentation, Institute of Cyber-Systems and Control,State Key Laboratory of Industrial Control Technology, Zhejiang University, Hangzhou 310058, China

Received:2014-11-28 Online:2015-04-10 Published:2015-03-27
Contact: ZHANG Tao,JIN Wei E-mail:zhtao@zju.edu.cn;jinweimy@gmail.com
Supported by:
† Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.21275129, 31270907)

摘要/Abstract

摘要：

设计了一种发卡型核酸探针, 结合脱氧核酶(DNAzyme)与支点介导链置换技术建立了一种检测端粒酶的新方法. 该发卡型探针通过阻碍G-四链体的形成来抑制DNAzyme的过氧化物酶活性. 当体系中的端粒酶引物TS被催化延伸后, 可以通过链置换反应破坏该发卡结构, 从而释放出自由的DNAzyme以催化过氧化氢氧化ABTS^2-, 产生可被检测的吸收信号变化. 实验结果表明, 应用该方法可以检测低至500个Hela细胞等当量的端粒酶, 且该方法操作简单、不需要荧光标记和复杂的表面修饰, 有望在肿瘤细胞端粒酶活性分析中获得广泛应用.

关键词: 端粒酶, 脱氧核酶, 辣根过氧化物酶, 信号放大, 支点介导链置换

Abstract:

A novel method for telomerase detection based on DNAzyme and toehold-mediated strand displacement was developed. Optimal designing of a hairpin probe ensured efficient inhibition of DNAzyme activity by preventing it from forming the G-quadruplex structure. After the substrate TS was elongated by telomerase, the original hairpin structure could be destroyed through toehold-mediated strand displacement, so that the free DNAzyme was released, which catalyzed the oxidation of ABTS^2- to generate an absorbance increase at 415 nm. The results indicated that the proposed method could detect the telomerase as low as 500 Hela cells equi-valent. Besides, this method is simple and requires no fluorescence labeling or complicated surface modification, and thus is expected to have a wide use in routine telomerase analysis of tumor cells.

Key words: Telomerase, DNAzyme, Horseradish peroxidase, Signal amplification, Toehold-mediated strand displacement

中图分类号:

O657

TrendMD:

范宏亮, 张涛, 金伟, 金钦汉. 基于脱氧核酶的无标记端粒酶检测新方法. 高等学校化学学报, 2015, 36(4): 625.

FAN Hongliang, ZHANG Tao, JIN Wei, JIN Qinhan. Novel Label-free Assay of Telomerase Based on DNAzyme^†. Chem. J. Chinese Universities, 2015, 36(4): 625.

图/表 7

Table 1 DNA sequences used in this experiment

DNA	Sequence
DZ	5'-TGGGTAGGGCGGGTTGGGA-3'(Free DNAzyme)
TM-1	5'-CTAACCCTAA CTCTGCT TGGGTAGGGCGGGTTGGGA GCAGAG-3'
TM-2	5'-CTAACCCTAA CTCTGCTC TGGGTAGGGCGGGTTGGGA GCAGAG-3'
TM-3	5'-CTAACCCTAA CTCTGCTCC TGGGTAGGGCGGGTTGGGA GCAGAG-3'
TM-4	5'-CTAACCCTAA CTCTGCTCCC TGGGTAGGGCGGGTTGGGA GCAGAG-3'
TM-31	5'-AACCCTAA CTCTGCTCC TGGGTAGGGCGGGTTGGGA GCAGAG-3'
TM-32	5'-CCCTAA CTCTGCTCC TGGGTAGGGCGGGTTGGGA GCAGAG-3'
TS	5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT
TS-02	5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT AG-3'
TS-04	5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT AGGG-3'
TS-06	5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT AGGGTT-3'
TS-08	5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT AGGGTTAG-3'
TS-R2	5'-AATCCGTCGAGCAGAGTT AGGGTTAGGGTT-3'

Scheme 1 Illustration of the proposed telomerase assay

Fig.1 Hairpin structures of TM1—TM4

Fig.2 Time-dependent absorbance changes of ABTS2-(5 mmol/L)/H2O2(5 mmol/L)/Hemin(300 nmol/L) in the presence of different probes(100 nmol/L)(A), absorbance changes of Hemin(5 mmol/L)/ABTS2-(5 mmol/L)/H2O2(300 nmol/L)/TM-x(100 nmol/L) after adding TS or TS-R2 for 120 s(B) and ratios of absorbance changes caused by TS-R2(200 nmol/L) and TS(200 nmol/L)(C)

Fig.3 Absorbance changes of TM-3(100 nmol/L)/Hemin(300 nmol/L)/ABTS2-(5 mmol/L)/H2O2(5 mmol/L) in the presence of various telomerase products(200 nmol/L)(A) and effects of overhang length on the absorbance change of TM-x(100 nmol/L)/Hemin(300 nmol/L)/ABTS2-(5 mmol/L)/H2O2(5 mmol/L) in the presence of TS or TS-R2(B)

Fig.4 Effects of Hemin concentration on absorbance change of TM-31(100 nmol/L)/ABTS(5 mmol/L)/H2O2(5 mmol/L) in the presence of TS or TS-R2(A) and effects of Hemin and ABTS2- concentrations on RTS-R2/TS value(B)

Fig.5 Time-dependent absorbance changes of TM-31(100 nmol/L)/Hemin(300 nmol/L)/ABTS(7.5 mmol/L)/H2O2(5 mmol/L) caused by TS-R2(A) and Hela cell extracts(B) (A) a. [TS]=200 nmol/L, TS-R2/(nmol·L-1): b. 20, c. 40, d. 60, e. 80, f. 100, g. 150, h. 200; (B) a. heat deactivated cells, b. 500 cells, c. 1000 cells, d. 2000 cells, e. 5000 cells.

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