石榴状凝胶微球固定化漆酶的制备、 表征及降解双酚A

doi:10.7503/cjcu20210705

摘要/Abstract

摘要：

采用铜/锌复合金属磷酸盐晶体和海藻酸钙凝胶双重包覆技术对漆酶进行固定化, 制得石榴状Alg@Cu₃/Zn₃(PO₄)₂@Lac的凝胶微球. SEM, EDX和FTIR表征结果表明, 在凝胶微球内部, 漆酶被成功固定于由海藻酸钙凝胶包覆的铜/锌复合金属磷酸盐晶体内, 铜/锌复合金属磷酸盐晶体镶嵌于海藻酸钙凝胶网格的孔隙中而呈石榴状. 以2,2′-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS)为底物, 经酶学性质研究表明, 在无机盐晶体和海藻酸钙凝胶的双重保护下, Alg@Cu₃/Zn₃(PO₄)₂@Lac的耐热性、耐酸性以及储存稳定性比游离漆酶均有不同程度增强. 将Alg@Cu₃/Zn₃(PO₄)₂@Lac应用于双酚A(BPA)的降解, 采用孔径约1 mm滤网实现快速回收, 经6次循环利用, 对BPA的降解率下降约14%, 显示出比较稳定的重复利用性和便捷的可操作性, 这主要得益于海藻酸钙和铜/锌无机盐晶体对漆酶蛋白分子的双重保护.

关键词: 铜/锌复合金属磷酸盐晶体, 海藻酸钙凝胶, 漆酶, 固定化, 双酚A

Abstract:

The pomegranate-like gel microsphere Alg@Cu₃/Zn₃（PO₄）₂@Lac was prepared by double embedding laccase in copper/zinc composite metal phosphate crystals and calcium alginate gel. Characterized by SEM， EDX and FTIR， the laccase was successfully embedded in copper/zinc composite metal phosphate crystals coated by calcium alginate. And the copper/zinc composite metal phosphate crystals were entrapped in the mesh pores of the calcium alginate gel like pomegranate-shaped. Enzymatic properties with ABTS as a substrate show that the heat resistance， acid resistance and storage stability of Alg@Cu₃/Zn₃（PO₄）₂@Lac are enhanced under the double protection of inorga-nic salt crystals and calcium alginate gel compared to free laccase. Alg@Cu₃/Zn₃（PO₄）₂@Lac was applied to the degradation of bisphenol A（BPA）， and an aperture diameter of approximately 1 mm filter was used to achieve rapid recovery. The degradation rate of BPA decreased by only about 14% after six cycles， showing relatively stable reavailability， mainly due to the dual protection of calcium alginate and copper/zinc inorganic salt crystals. This paper provides the method and basis for establishing a new immobilization technology to enzyme.

Key words: Copper/zinc composite metal phosphate crystal, Calcium alginate gel, Laccase, Immobilization, Bisphenol A（BPA）

中图分类号:

O643.3

TrendMD:

周宁, 唐小华, 曹红, 查飞, 李春, 谢春燕, 徐明平, 孙艺格. 石榴状凝胶微球固定化漆酶的制备、表征及降解双酚A. 高等学校化学学报, 2022, 43(2): 20210705.

ZHOU Ning, TANG Xiaohua, CAO Hong, ZHA Fei, LI Chun, XIE Chunyan, XU Mingping, SUN Yige. Preparation， Characterization and Degradation to BPA of Pomegranate-like Gel Microsphere Entrapmented Laccase. Chem. J. Chinese Universities, 2022, 43(2): 20210705.

图/表 13

Scheme 1 Formation of a free radicals ABTS·* from ABTS

Fig.1 SEM images of Cu3/Zn3(PO4)2@Lac(A) Cu3/Zn3(PO4)2@Lac at 3 h; (B) Cu3/Zn3(PO4)2@Lac at 48 h; (C) microscopic magnification of a single sphere of Cu3/Zn3(PO4)2@Lac.

Fig.2 EDX spectrum of Cu3/Zn3(PO4)2@Lac

Fig.3 FTIR spectra of Cu3/Zn3(PO4)2@Laca. Laccase; b. copper phosphate crystal; c. zinc phosphate crystal; d. Cu3/Zn3(PO4)2@Lac.

Scheme 2 Formation process of Cu3/ Zn3(PO4)2@Lac crystals

Fig.4 SEM images of profile of blank calcium alginate microspheres and Alg@Cu3/Zn3(PO4)2@Lac microspheres(A) Blank calcium alginate microspheres; (B) Alg@Cu3/Zn3(PO4)2@Lac microspheres.

Scheme 3 Preparation process of Alg@Cu3/ Zn3(PO4)2@Lac gel microsphere

Fig.5 Relationship between the relative enzyme activity of Alg@Cu3/Zn3(PO4)2@Lac(a) and Free?Lac(b) and the pH of the substrate solution

Fig.6 Relationship between relative enzyme activity of Alg@Cu3/Zn3(PO4)2@Lac(a) and Free?Lac(b) and reaction temperature

Fig.7 Storage stability of of Free?Lac(a), Cu3/Zn3(PO4)2@ Lac(b) and Alg@Cu3/Zn3(PO4)2@Lac(c)

Fig.8 Lineweaver?Burk graphs of Alg@Cu3/Zn3(PO4)2@ Lac(a) and Cu3/Zn3(PO4)2@Lac(b)

Table 1 Comparison of kinetic parameters of Cu3/Zn3(PO4)2@Lac and Alg@ Cu3/Zn3(PO4)2@Lac

Gel microsphere	Michaelis?Menten equation	v_max/（mmol·L^-1·min^-1）	K_m/（mmol·L^-1）
Cu₃/Zn₃（PO₄）₂@Lac	y=1.039x+3.277	0.305	0.317
Alg@Cu₃/Zn₃（PO₄）₂@Lac	y=7.182x+13.712	0.0729	0.523

Fig.9 Recyclability of BPA degradation by Alg@Cu3/Zn3(PO4)2@Lac

参考文献 34

1	Ge J.， Lei J.， Zare R. N.， Nat. Nanotechnol.， 2012， 7（7）， 428—432
2	Li Z.， Zhang Y.， Su Y.， Ouyang P.， Ge J.， Liu Z.， Chem. Commun.， 2014， 50（83）， 12465—12468
3	Li Z.， Ding Y.， Wu X.， Ge J.， Ouyang P.， Liu Z.， RSC Adv.， 2016， 6（24）， 20772—20776
4	He X.， Chen L.， He Q.， Xiao H.， Zhou X.， Ji H.， Chin. J. Chem.， 2017， 35（5）， 693—698
5	Patel S. K. S.， Otari S. V.， Li J.， Kim D. R.， Kim S. C.， Cho B. K.， Kalia V. C.， Kang Y. C.， Lee J. K.， J. Hazard. Mater.， 2018， 347（4）， 442—450
6	Batule B. S.， Park K. S.， Gautam S.， Hong J. C.， Kim M. I.， Park H. G.， Sensor. Actuat. B： Chem.， 2019， 283（3），749—754
7	Yang H. F.， He P. P.， Yin Y. C.， Mao Z. L.， Zhang J.， Zhong C. L.， Xie T.， Wang A. M.， Bioproc. Biosyst. Eng.， 2021， 44（5）， 2061—2073
8	Ye R.， Zhu C.， Song Y.， Lu Q.， Ge X.， Yang X.， Zhu M. J.， Du D.， Li H.， Lin Y.， Small， 2016， 12（23）， 3094—3100
9	Chen X.， Xu L.， Wang A.， Li H.， Wang C.， Pei X.， Zhang P.， Gang W. S.， J. Chem. Technol. Biot.， 2019， 94（1）， 236—243
10	Altinkaynak C.， Tavlasoglu S.， Ÿzdemir N.， Ocsoy I.， Enzyme Microb. Tech.， 2016， 93/94（11）， 105—112
11	Ke C.， Fan Y.， Chen Y.， Xu L.， Yan Y.， RSC Adv.， 2016， 6（23）， 19413—19416
12	Zhang B.， Li P.， Zhang H.， Li X.， Tian L.， Wang H.， Chen X.， Ali N.， Ali Z.， Zhang Q.， Appl. Surf. Sci.， 2016， 366（3）， 328—338
13	Zhang B.， Li P.， Zhang H.， Fan L.， Zhang Q.， RSC Adv.， 2016， 6（52）， 46702—46710
14	Zhang Z.， Zhang Y.， He L.， Yang Y.， Liu S.， Wang M.， Fang S.， Fu G.， J. Power Sources， 2015， 284（6）， 170—177
15	Soni S.， Dwivedee B. P.， Banerjee U. C.， Chemnanomat， 2018，4（9）， 1007—1020
16	Munyemana J. C.， He H.， Ding S.， Yin J.， Xi P.， Xiao J.， Rsc Adv.， 2018， 8（5）， 2708—2713
17	Gallego F. L.， Yate L.， Chem. Commun.， 2015， 51（42）， 8753—8756
18	Cao T. T.， Zheng J.， Xu J. L.， Alharbi N. S.， Zhang M.， New J. Chem.， 2019， 43（40）， 15946—15955
19	Sharma B.， Dangi A. K.， Shukla P.， J. Environ. Manage.， 2018， 210（3）， 10—22
20	Zhu Y.， Ouyang X. P.， Zhao Y.， Jiang L.， Guo H.， J. Energy Chem.， 2018， 27（3）， 801—805
21	Duan B. Y.， Wang Y.， Guo N. N.， Wang R. W.， Zhang Z. T.， Qiu S. L.， Chem. J. Chinese Univertsities， 2019， 40（2）， 210—215（段秉怡，王宇，郭宁宁，王润伟，张宗弢，裘式纶. 高等学校化学学报， 2019， 40（2）， 210—215）
22	Mokhtar A.， Nishioka T.， Matsumoto H.， Kitada S.， Ryuno N.， Okobira T.， Int. J. Biol. Macromol.， 2019， 130（10）， 737—744
23	Girelli A. M.， Scuto F. R.， Waste Manage.， 2021， 128（6）， 114—121
24	Shokri Z， Seidi F， Karami S， Li C.， Xiao H.， Carbohyd. Polym.， 2021， 262（14）， 117963
25	Mani P.， Fidal V. T.， Keshavarz T.， Chandra T. S.， Kyazze G.， Front. Microbiol.， 2021， 11（1）， 620075
26	Yadav D.， Ranjan B.， Mchunu N.， Roes-Hill M. L.， Kudanga T.， Biotech， 2021， 11（6）， 302
27	Patel S.， Choi H.， Lee J. K.， ACS Sustain. Chem. Eng.， 2019， 7（16）， 13633—13638
28	Liao J. F.， Wang B. Y.， Huang Y. X.， Qu Y.， Peng J. R.， Qian Z. Y.， ACS Omega， 2017， 2（2）， 443—454
29	Huang X. L.， Xie H.， Cao H.， Jing H. J.， Li C.， Wu T. H.， Chem. J. Chinese Univertsities， 2019， 40（4）， 793—799（黄晓林，谢睆，曹红，金宏杰，李春，吴廷华. 高等学校化学学报， 2019， 40（4）， 793—799）
30	Isik Z.， Saleh M.， Dizge N.， Surf. Interfaces， 2021， 26（10）， 101330
31	Guo J.， Jiang J. G.， Gu X. L.， Colloid. Surface. A， 2021， 608（1）， 125548
32	Wang W. H.， Yang X.， Li F.， Sun M. M.， Wang Y. L.， Meng T.， CIESC J.， 2019， 70（12）， 4777—4786（王伟浩，杨鑫，李飞，孙梦梦，王垚磊，孟涛. 化工学报， 2019， 70（12）， 4777—4786）
33	Sun J.， Ge J.， Liu W.， Lan M.， Niu Z.， Nanoscale， 2014， 6（11）， 255—262
34	Zhang B.， Li P.， Zhang H.， Wang H.， Li X.， Tian L.， Ali N.， Ali Z.， Zhang Q.， Chem. Eng. J.， 2016， 291（2）， 287—297

[1]	朱浩天, 金美秀, 唐文思, 苏芳, 李阳光. 过渡金属-联咪唑-Dawson型钨磷酸盐杂化化合物的酶固定化性能[J]. 高等学校化学学报, 2022, 43(11): 20220328.
[2]	李柳, 孙仕勇, 吕瑞, GOLUBEVYevgeny Aleksandrovich, 王可, 董发勤, 段涛, KOTOVAOlga Borisovna, KOTOVAElena Leonidovna. 铁氨基黏土-葡萄糖氧化酶纳米复合催化剂的构筑及多酶级联反应研究[J]. 高等学校化学学报, 2021, 42(3): 803.
[3]	王欢, 所金泉, 王春艳, 王润伟. 氨基化树枝状介孔二氧化硅固定葡萄糖氧化酶用于检测葡萄糖[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(8): 1731.
[4]	高霞,潘会宾,乔成芳,陈凤英,周元,杨文华. 基于多级孔金属有机骨架构筑HRP固定化酶反应器及其染料降解应用[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(7): 1591.
[5]	沙心易, 张常旭, 汪羽翎, 周永丰. 基于儿茶酚交替共聚物的干湿态双高效胶黏剂材料[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(7): 1477.
[6]	吴蓉, 董其惠, 孙伊伊, 苏二正. 吸附-纤维素覆膜联合固定化酶[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(9): 1888.
[7]	宋艺超, 胡满成, 李淑妮, 翟全国, 蒋育澄. 基于中心辐射树枝状介孔二氧化硅构筑CPO固定化酶反应器及应用[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(9): 1805.
[8]	黄晓林, 谢睆, 曹红, 金宏杰, 李春, 吴廷华. 磁芯负载离子液体凝胶微球的制备、表征及在固定化细胞技术中的应用[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(4): 793.
[9]	段秉怡, 王宇, 郭宁宁, 王润伟, 张宗弢, 裘式纶. 蛋黄-壳结构Fe₃O₄@SiO₂@PMO磁性微球的制备及对漆酶的固定化[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(2): 210.
[10]	范小雨,王可,孙仕勇,马彪彪,吕瑞. 铁氨基黏土纳米结构脂肪酶的构筑及催化特性[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(12): 2512.
[11]	高丰琴, 王珊, 王云芳, 赵丹蕾, 崔茹, 蒋育澄. 磁性氧化石墨烯固定化氯过氧化物酶及其在奥酸性蓝45脱色中的应用[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(5): 904.
[12]	李文娟, 赵一雷. 白腐菌漆酶耐盐性的生物信息学研究及氯离子、氧气和水分子输运通道分析[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(2): 255.
[13]	焦晶, 杨雪, 金兰娜, 高键, 周洋, 肖亚中, 张应玖. 枯草杆菌漆酶重要功能位点的保守性与可变性分析[J]. 高等学校化学学报, 2016, 37(7): 1320.
[14]	王碧翠, 王蔚, 张经纬, 袁直. 纳米金对内皮细胞黏附和增殖行为的调控[J]. 高等学校化学学报, 2015, 36(8): 1619.
[15]	方燕, 马琳琳, 陕多亮, 卢小泉. 石墨烯-金纳米粒子复合膜修饰电极的制备及对双酚A的测定[J]. 高等学校化学学报, 2015, 36(8): 1491.