肿瘤乏氧靶向响应的罗丹明荧光探针及其成像介导手术治疗

doi:10.7503/cjcu20210316

高等学校化学学报 ›› 2021, Vol. 42 ›› Issue (10): 3071.doi: 10.7503/cjcu20210316

肿瘤乏氧靶向响应的罗丹明荧光探针及其成像介导手术治疗

王萌萌¹, 栾天骄¹, 杨铭焱¹, 吕佳佳¹, 高杰¹, 李洪玉¹, 卫钢², 袁泽利¹()

^1.遵义医科大学药学院, 基础药理教育部重点实验室, 特色民族药教育部国际联合实验室, 贵州省生物催化与手性药物重点实验室, 贵州省医用光学诊疗技术与创新药物研究国际科技合作基地, 遵义 563000
^2.澳大利亚联邦科学与工业组织(CSIRO), 新南威尔士州 2070

收稿日期:2021-05-07 出版日期:2021-10-10 发布日期:2021-10-10
通讯作者: 袁泽利 E-mail:zlyuan2002@126.com
基金资助:
国家自然科学基金(81660575);贵州省创新群体重大项目(批准号: KY[2018] 024)、遵义医科大学学术新苗项目(批准号: [2017]5733-042)、遵义医科大学博士启动基金(F-862);贵州省科技支撑计划(批准号: 黔科合支撑[2020]4Y158号)和贵州省科技厅平台项目(批准号: [2020]4104号)资助

Rhodamine Fluorescent Probe for Tumor Targeted Hypoxia-imaging as Intra-operative Navigators

WANG Mengmeng¹, LUAN Tianjiao¹, YANG Mingyan¹, LYU Jiajia¹, GAO Jie¹, LI Hongyu¹, WEI Gang², YUAN Zeli¹()

^1.School of Pharmacy，Key Laboratory of Basic Pharmacology of Ministry of Education，Key Laboratory of Biocatalysis & Chiral Drug Synthesis of Guizhou Province，International Joint Laboratory of Characteristic Ethnic Medicine of the Ministry of Education，Guizhou International Scientific and Technological Cooperation Base for Medical Photo?Theranostics Technology and Innovative Drug Development，Zunyi Medical University，Zunyi 563000，China
^2.Commonwealth Scientific and Industrial Research Organisation（CSIRO） Manufacturing，NSW 2070，Australia

Received:2021-05-07 Online:2021-10-10 Published:2021-10-10
Contact: YUAN Zeli E-mail:zlyuan2002@126.com

摘要/Abstract

摘要：

基于罗丹明的良好荧光性能, 经化学偶联反应制备并表征了一个偶氮乏氧特异响应的“Off-On”型荧光成像探针(FY-4). 从分子层面证实了其荧光“Off-On”性能和响应机制; 在L02正常细胞及4T1, HeLa和A549肿瘤细胞层面考察了其对受试细胞株的毒性和不同乏氧时间的荧光成像性能; 再利用4T1肿瘤模型, 分别以肿瘤原位注射和尾静脉注射的方式考察了其荧光成像性能, 并探究了其荧光成像介导切除肿瘤性能, 最后还考察了FY-4的生物安全性. 结果表明, FY-4有高的肿瘤乏氧靶向特异“关-开”响应的荧光成像差异显影及荧光成像介导切除肿瘤的潜能, 结合其良好的光物理性能、生物安全性和明晰的给药时间等特性, 有望为生物医学荧光成像介导肿瘤切除提供新的研究工具.

关键词: 乏氧探针, 偶氮还原酶, 荧光成像, 罗丹明衍生物, 成像介导肿瘤切除

Abstract:

Determination of tumor boundary during surgery has a great significance to achieving precise resection. The level of tumor hypoxia is closely related to the local concentration of reducing substances such as azobenzene reductases（azoreductases， AzoR， an important class of biocatalysts in solid tumor）， AzoR is able to reduce the nitrogen double bond（—N=N—） of azobenzene compounds to generate anilines. Therefore， the characterization might serve as optical AzoR probe during image-guided surgery， which exhibits wide range of application prospects in biomedicine field. In order to obtain a probe for tumor hypoxia fluorescence image-guided surgery with good targeting， low toxicity， good biocompatibility and high specificity， based on the molecular cleavage of azobenzene induced by azoreductase hypoxia and the good fluorescence performance of rhodamine， an “Off-On” type tumor with a specific response to near-infrared azohypoxia was prepared and characterized by chemical coupling. Then we confirmed its fluorescence “Off-On” performance and response mechanism from the molecular level； at the level of L02， 4T1， HeLa， and A549 tumor cells， the toxicity of the tested cell lines and the imaging performance on different hypoxia periods was also investigated. Next， 4T1 tumor model was further constructed， and the performance of tumor in situ injection and tail vein injection fluorescence imaging were studied respectively. Furthermore， the performance of fluorescence imaging-mediated surgery of tumors was further explored. On this basis， the biological safety performance was investigated. The results show that this rhodamine azo probe has high target-specific tumor hypoxia responsiveness and excellent fluorescence imaging-mediated tumor surgery potential， combined with its good photophysical properties， controlled administration time， and biological security， which is expected to provide new research tools for biomedical fluorescence imaging-mediated tumor resection.

Key words: Hypoxia probe, Azoreductase, Fluorescence image, Rhodamine derivatives, Imaging-mediated tumor resection

中图分类号:

O657

TrendMD:

王萌萌, 栾天骄, 杨铭焱, 吕佳佳, 高杰, 李洪玉, 卫钢, 袁泽利. 肿瘤乏氧靶向响应的罗丹明荧光探针及其成像介导手术治疗. 高等学校化学学报, 2021, 42(10): 3071.

WANG Mengmeng, LUAN Tianjiao, YANG Mingyan, LYU Jiajia, GAO Jie, LI Hongyu, WEI Gang, YUAN Zeli. Rhodamine Fluorescent Probe for Tumor Targeted Hypoxia-imaging as Intra-operative Navigators. Chem. J. Chinese Universities, 2021, 42(10): 3071.

图/表 7

Fig.1 Structures of FY and FY?4(A), absobance(B) and fluorescence(C) spectra of FY， FY?4 and FY?4+Na2S2O4 in a mixture of PBS and DMSO buffer(volume ratio： 9/1， pH=7.4) at room temperature, a visual change photograph of FY?4 and FY?4+Na2S2O4(D), schematic diagram for some calculated frontier molecular orbital energies of FY(E) and FY?4(F)， and fluorescence spectral changes for FY?4(10 μmol/L) in the presence of different concentrations of Na2S2O4 in PBS/DMSO buffer (volume ratio： 9/1， pH=7.4)(G)

Fig.2 Fluorescence enhancement of FY?4(10 μmol/L) after treated with Na2S2O4(5 mmol/L) at various time(0—4 min)(A), fluorescent response of FY?4(10 μmol/L) to various reductants(B), fluorescence intensity of FY, FY?4 and FY?4+Na2S2O4 at various ranges of pH in PBS/DMSO(volume ratio: 9/1, pH=7.4)(C), HPLC chromatograms of FY, FY?4 and FY?4+Na2S2O4(D) and proposed fracture mechanism of FY?4 under Na2S2O4 environment(E)(B) FY?4 was treated with various reductants under normoxia and hypoxia conditions at 37 ℃ in PBS(10 mmol/L, pH=7.4) for 30 min. a. Cys; b. GSH; c. VC; d. NADH; e. H2O2; f. Glucose; g. HClO; h. Na2S2O4.

Fig.3 Schematic diagram of hypoxia experiment(A), fluorescence images(B) and intensities(C) of HeLa cell lines incubated with FY?4(10 μmol?/L) under different incubating time(B) Scars=20 μm.

Fig. 4 Real?time in vivo fluorescent images(A) and intensities(B) of different sized 4T1 tumor?bearing mice after the intratumoral injection of FY?4(100 μL, 500 μmo/L)

Fig.5 Real?time fluorescence images of 4T1 tumor?bearing mice after intravenous injection of FY?4(100 μL, 2 mmol/L per mouse) for different time(A), bio?distribution(B) and the fluorescence intensity(C) of FY?4 in the heart, liver, spleen, lung, kidney, brain, and tumor tissues after tail?vein injection of FY?4(100 μL, 2 mmol/L) for 10 h(C) a. Kidney; b. heart; c. liver; d. spleen; e. tumor; f. lung.

Fig.6 H&E staining of heart, liver, spleen, lung and kidney sections from mice bearing 4T1 tumors with different treatments(scars=20 μm)(A); blood biochemistry tests of ALT(B), AST(C), Cr(D) and Ucrea(E) from mice treated with different formulationsa. 100 μL of PBS; b. 100 μL of FY?4(500 μmol/L)(n=3).

Fig.7 Illustrative fluorescence?guided surgery of a mice bearing a 4T1 tumor, 30 min p.i. of FY?4(100 μL, 500 μmol/L)(A), fluorescence images of Ⅰ and Ⅱ through injecting FY?4(100 μL, 500 μmol/L) for 30 min(B), statistical fluorescence intensities of Ⅰ and Ⅱ(C) and fluorescent images of tissue slices Ⅰ and Ⅱ based on (B)(D)(A) i. bright image; ii. fluorescence image; iii. injecting FY?4 for 30 min then fluorescence image; iv. based on iii, resecting of tumor then fluorescence image. (D)Ⅰ. a normal muscle tissue on the edge of tumor; Ⅱ. a 4T1 tumor. Scars=20 μm.

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