乏氧激活化疗药物AQ4N与碳点自组装用于化疗联合声动力治疗肿瘤 高等学校化学学报    2025, 46 (6): 20240489-.   DOI:10.7503/cjcu20240489

Fig.3 In vitro cellular experiments in different treatment groups
Fluorescence images of 4T1 cells were stained using DCFH-DA probe（A） or Calcein AM/PI（B） after different treatments； the viability of 4T1 cells was incubated using different concentrations of CDs@AQ4N in normoxic（C） and hypoxic condition（D） with or without US irradiation（1.0 W/cm²， 100% duty cycle， 30 s）.

正文中引用本图/表的段落

CDs可通过静电相互作用、 氢键及π-π相互作用与AQ4N组装［图2（A）］. 如图2（B）所示， CDs的Zeta电势约为－6 mV， AQ4N的Zeta电势约为14.5 mV， CDs@AQ4N组装体的Zeta电势约为7.7 mV， 表明CDs和AQ4N已通过静电作用成功组装. CDs与AQ4N组装前后的归一化紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱（相同浓度下的吸收光谱见本文支持信息图S2， CDs与AQ4N的浓度标准曲线如本文支持信息图S3和S4）也证明了CDs与AQ4N的成功组装. 如图2（C）所示， CDs@AQ4N的吸收光谱同时显示出CDs和AQ4N的吸收峰； 而CDs的荧光发射峰位于676 nm处， AQ4N的荧光发射峰位于690和740 nm处， 但AQ4N的荧光强度相对较弱［图2（D）插图］. 在组装完成后， CDs@AQ4N中源于CDs的荧光发生明显猝灭［图2（D）］， 这可能是由于CDs与AQ4N的π-π相互作用导致CDs聚集荧光猝灭. 实验中采用9，10-蒽二基-双（亚甲基）二甲酸钠（ABDA-Na₂）作为1O₂捕获剂， 对CDs及CDs@AQ4N的声动力性能进行了评估. 如图2（E）所示， CDs与ABDA-Na₂混合溶液的吸收光谱显示， 随着超声照射时间的增加， ABDA-Na₂的吸收峰降低， 表明在超声照射下CDs能够产生大量的1O₂. 在相同条件下测试了AQ4N与ABDA-Na₂混合溶液的吸收光谱， 结果显示AQ4N同样具有声敏剂活性（见本文支持信息图S5）， 而CDs@AQ4N组装体则显示出比单独的CDs或AQ4N更强的声动力活性［图2（F）~（G）］.

采用2，7-二氯荧光素二乙酸酯（DCFH-DA）作为细胞内ROS探针， 在体外细胞内验证了CDs@AQ4N产生ROS的能力. 如图3（A）所示， CDs@AQ4N+US组的4T1细胞显示出明亮的绿色荧光， 而其余3个对照组（PBS组、 PBS+US组和CDs@AQ4N组）细胞中则未观察到明显荧光， 表明CDs@AQ4N在超声照射下能够在细胞内产生1O₂. 为了进一步评估CDs@AQ4N对肿瘤细胞的声动力毒性和乏氧化疗毒性， 利用钙黄绿素-AM/碘化丙啶（Calcein AM/PI）对经不同处理后的4T1细胞的活/死情况进行了可视化分析. 如图3（B）所示， 与PBS组和PBS+US组相比， CDs@AQ4N组的部分细胞发出红色荧光， 表明CDs@AQ4N组有少部分细胞死亡， 这是由于AQ4N在乏氧下激活化疗作用所致； 而CDs@AQ4N+US组的大部分细胞均发出明亮的红色荧光， 表明在CDs的声动力作用协同下， CDs@AQ4N+US组对肿瘤细胞具有较好的抑制作用.

为了对CDs@AQ4N的细胞毒性、 声动力性能和乏氧化疗毒性进行定量评估， 采用MTT法测试了不同条件、 不同浓度下细胞的存活率. 如图3（C）所示， 在常氧条件下， CDs@AQ4N未显示出明显的细胞毒性， 细胞活力约为90%， 说明CDs具有良好的生物相容性， 且AQ4N的化疗毒性在常氧条件下没有被激活； 当CDs@AQ4N中CDs和AQ4N的浓度分别为3 μg/mL和1.34 μmol/L时， 在超声照射下， 细胞活力降低至约35%， 这是CDs的声动力效应导致的. 如图3（D）所示， 在乏氧条件下， 当CDs@AQ4N中CDs和AQ4N的浓度分别为3 μg/mL和1.34 μmol/L时， 即使没有超声照射， CDs@AQ4N也显示出明显的化疗毒性， 细胞活力降低至约50%； 在超声照射下， 肿瘤细胞活力进一步降低， 约为15%. 以上结果证明CDs@AQ4N具有优异的生物安全性和声动力/乏氧激活化疗疗效， 在常氧条件下CDs@AQ4N不会产生毒性， 而在肿瘤组织乏氧条件下化疗效果被激活， 同时进行SDT， 从而实现最佳的协同治疗效果.

本文的其它图/表

• Fig.1  TEM, XPS, FTIR characterizations of CDs（A） TEM images of CDs（insert shows the HRTEM of CDs）； （B） size distribution statistics； （C） XPS spectra of CDs； （D—F） the deconvolution of high resolution C_1s， N_1s， O_1s XPS spectra of CDs， respectively； （G） FTIR spectra； （H） UV-Vis absorption spectrum； （I） fluorescence spectra at different excitation wavelengths of CDs.
• Fig.2  Assembly of CDs with AQ4N and the ¹O₂ generating capacity assay（A） The schematic representation of the self-assembly of CDs and AQ4N through hydrogen bonding， π-π interactions and electrostatic interactions； （B） Zeta potential diagram of CDs， AQ4N and CDs@AQ4N； （C） Normalized UV-Vis absorption spectra； （D） fluorescence spectra of CDs（black）， AQ4N（red） and CDs@AQ4N（blue）； absorption spectra of ABDA-Na₂ in the presence of CDs（E） and CDs@AQ4N（F） under US irradiation（1.0 W·cm^-2， 100% duty cycle， 1 MHz， 10 min）； （G） the absorption decay rate of ABDA-Na₂.
• Fig.4  In vivo animal experiments in different treatment groups（A） Fluorescence imaging picture of mice after intratumoral injection of CDs@AQ4N（L： left tumor， R： right tumor； E_x=600 nm， E_m=670 nm）； （B—F） variation of tumor volume of different treatment groups； （G） photographs of tumors of different treatment groups after the end of treatment（n=5）； （H） variation of body weight of mice in different treatment groups； tumor tissue of mice in different treatment groups H&E（I）， Ki67（J）， TUNEL（K） and HIF-1α（L） section staining images.
• Fig.5  Photographs of major organ sections
• Fig.6  Biosafety assays for CDs@AQ4NRoutine blood analyses（A—H） and blood biochemical analyses（I—O） of mice from different treatment groups. Significance was determined by one-way ANOVA with Tukey’s multiple comparison test， *p<0.05， **p<0.01， ns stands for no significant difference.