水溶性香豆素荧光底物的制备及在液滴数字式检测中的应用 高等学校化学学报    2021, 42 (11): 3537-3546.   DOI:10.7503/cjcu20210459

Fig.4 Droplet based digital detection of SP?AKP using 4?MUP and C?4
(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) of SP?AKP at λ_T=0.0007(A₁), 0.007(A₂), 0.069(A₃), and 0.312(A₄) using 4?MUP after 10 min incubation. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images (insert pictures) of SP?AKP at λ_T=0.0007(B₁), 0.007(B₂), 0.069(B₃), and 0.312(B₄) using C?4 after 20 min incubation. The experimental λ_Tversus theoretical λ_T using 4?MUP(C) and C?4(E). The ordinate and horizontal axis indicate the experimental λ_T and the theoretical λ_T, respectively. The experimental λ_Tversus SP?AKP concentration using 4?MUP(D) and C?4(F).

正文中引用本图/表的段落

为了探究底物C-4在ddELISA检测中的检测性能， 以4-MUP底物作为参照， 使用球刷酶SP-AKP模拟待测物进行数字式检测. 根据2.3节所得结果分别选择10 和20 min作为4-MUP和C-4的孵育时间. 图4（A）， （C）和（D）示出了4-MUP在模拟数字式检测中的结果. 由于4-MUP的酶催化荧光产物4-MU扩散性较强， 较难区分阳性峰和阴性峰. 故实验中以最低λ_T（0.0007）时的结果为标准， 对此条件下的阴性液滴峰进行高斯拟合， 采用阴性液滴峰的平均值加上10倍标准差作为区分阴阳性峰的阈值， 所有浓度均使用该阈值. 由图4（A）和（C）可见， 随着SP-AKP浓度的增加， 即理论λ_T的增加， 实验所得实际λ_T也随之增加. 然而由于荧光产物4-MU的扩散， 即使在较低λ_T（0.0007）时， 依然存在荧光物质扩散的现象［见图4（A）］， 阳性液滴和阴性液滴判读困难， 导致每个浓度的变异系数（CV）均高于20%. 在理论λ_T低于0.069时， 检测得到的实际λ_T低于理论λ_T， 说明部分阳性液滴由于荧光扩散的影响被划为阴性液滴. 但是在高浓度时由于阳性液滴数量较多， 大量荧光产物4-MU扩散进入阴性液滴， 部分阴性液滴因荧光强度升高而被划为阳性液滴， 导致最终计算得到的实际λ_T远大于理论λ_T. 从结果来看， 4-MUP的检测时间较难控制， 且在不同SP-AKP浓度下均会受到扩散的影响， 阴性、 阳性峰区分不明显， 判读误差大， 难以应用于基于液滴的酶促数字式检测中.

底物C-4则展示了优异的数字式检测性能. 由图4（B）可见， 随着SP-AKP浓度的增加， 均能明显区分阳性峰和阴性峰. 由图4（E）可以看出， 实际得到的λ_T与理论λ_T符合， 一致性高， 除背景CV略大于20%， 其余浓度下的检测CV均低于10%. 即使在高浓度λ_T=0.55的检测中， CV仅为6%， 依然保持了较低的变异系数.以背景加3倍的标准差计算检出限（LOD）， 发现该检测体系LOD达到了29.9 amol/L ［图4（F）］， 与相同体系使用微阵列隔离液滴降低扩散的方法相比降低了一个数量级［11］， 显著优于传统的酶促数字式检测体系. 本文方法的线性范围为29.9 amol/L~14.5 fmol/L， 检测范围近3个数量级， 也比微阵列隔离的数字式检测方法显著提升. 以上结果均证明， 本文构建的底物C-4适用于基于液滴的酶促数字式检测， 并可达到比传统数字式检测方法更优的检测性能与线性范围.

本文的其它图/表

• Scheme 1  Schematic of droplet based digital detection
• Scheme 2  Syntheses of alkaline phosphatase substrate 7?(dihydroxyphosphoryloxyl) coumarin?4?acetic acid methyl ester(C?4)
• Fig.1  Basic property characterization of 4?MU, C?2, 4?MUP, C?4 and SP?AKP（A） The fluorescence spectra and partition coefficients（lg D） of 4?MU and C?2； （B） the fluorescence intensity standard curves of 4?MU and C?2； （C） the Michaelis?Menten equation of corresponding substrate C?4 and 4?MUP； （D） the catalytic activity comparison of AKP and SP?AKP.The concentrations of AKP and SP?AKP are 1×10^-6 mg/mL and 12.17×10^-6 mg/mL， respectively.
• Fig.2  Characterization of fluorescent product(C?2 and 4?MU) leakage in droplets(A) Fluorescence images of 4?MU in droplets at 0(A₁), 5(A₂), 10(A₃) and 20 min(A₄). (B) Fluorescence images of C?2 in droplets at 0 min (B₁), 30 min (B₂), 60 min (B₃) and 24 h (B₄). Corresponding fluorescence intensity distribution of droplets using 4?MU(C) and C?2(D). Different color indicates different incubation times after droplet generation. (E) Evolution of positive droplet fraction using C?2 and 4?MU over time.The ordinate and horizontal axis indicate the proportion of positive droplets and incubation time, respectively.
• Fig.3  Characterization of 4?MUP and C?4 in droplets over time(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(A₁), 5 min(A₂), 10 min(A₃), and 30 min(A₄) incubation of 4?MUP substrate under λ=0.04. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(B₁), 10 min(B₂), 20 min(B₃), and 60 min(B₄) incubation of C?4 substrate under λ=0.55. Summary of florescence distribution after different incubation time using 4?MUP(C) and C?4(E). Different color indicates different incubation times after droplet generation. The experimental λ of 4?MUP(D) and C?4(F) over time.