水溶性香豆素荧光底物的制备及在液滴数字式检测中的应用 高等学校化学学报    2021, 42 (11): 3537-3546.   DOI:10.7503/cjcu20210459

Fig.3 Characterization of 4?MUP and C?4 in droplets over time
(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(A₁), 5 min(A₂), 10 min(A₃), and 30 min(A₄) incubation of 4?MUP substrate under λ=0.04. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(B₁), 10 min(B₂), 20 min(B₃), and 60 min(B₄) incubation of C?4 substrate under λ=0.55. Summary of florescence distribution after different incubation time using 4?MUP(C) and C?4(E). Different color indicates different incubation times after droplet generation. The experimental λ of 4?MUP(D) and C?4(F) over time.

正文中引用本图/表的段落

在验证了对应荧光产物的防扩散性能后， 进一步对2种底物在液滴数字式检测体系中的防扩散性能进行了验证. 在2.5 mmol/L底物终浓度下， 测试了不同孵育时间下的液滴荧光强度分布， 结果如 图3（A）和（B）所示. 将SP-AKP分散液与5 mmol/L的底物按体积比1∶1混合后， 加入液滴生成仪中生成液滴； 在室温下孵育不同时间后， 将液滴放入液滴存储腔中进行观察. 在随机分布中， 当目标物SP-AKP的浓度较低时， 每个液滴中装载的SP-AKP数量服从泊松分布. 大部分液滴均没有装载SP-AKP（阴性液滴）， 只有少部分的液滴装载1个或多个SP-AKP（阳性液滴）. 使用理论上每个液滴中装载的平均SP-AKP的数量（λ_T）来计算SP-AKP的浓度， λ_T使用泊松分布公式计算 ［19］：

由于4-MUP扩散性较强， 实验选用较低的SP-AKP浓度（平均每个液滴可以分配0.04个SP-AKP， 即理论λ_T=0.04）， 结果如图3（A）所示. 由于4-MUP酶促荧光产物4-MU的扩散， 使得阳性液滴与阴性液滴荧光强度分布峰难以区分， 故采用统一阈值的方法. 以阳性峰和阴性峰区分较为明显的10 min为基准， 将阳性峰和阴性峰相交处的荧光强度确定为区分阳性和阴性液滴的阈值， 以此阈值作为其余时间点的阳性和阴性液滴的划分界限. 图3（C）和（D）分别为孵育不同时间下的液滴荧光强度分布和实际计算得到的λ_T. 可以看出， 4-MUP在实际孵育过程中， 阳性液滴的荧光强度逐渐升高， 实际计算的λ_T也逐渐升高， 在孵育10 min时与理论λ_T最为接近. 后续由于荧光产物4-MU的扩散影响， 孵育10 min后实际计算的λ_T超过了理论λ_T， 说明大量的阴性液滴由于荧光强度增加而被划分为阳性液滴. 从图3（A）中 30 min的液滴荧光图也可看出阳性液滴出现明显扩散现象， 导致其周围的阴性液滴荧光强度显著增加， 难以与阳性液滴区分， 从而影响检测结果. 该结果与文献［11］报道一致.

由图3（B）与3（E）可见， 与4-MUP相比， C-4在10 min时即可较好区分阴性液滴与阳性液滴， 且随着孵育时间的延长， 阳性液滴的荧光强度逐渐增加， 而阴性液滴荧光强度基本不变； 孵育20 min时阳性液滴信号峰已与阴性液滴完全分离； 延长孵育时间至60 min时， 阳性液滴和阴性液滴依然可明显区分. 由图3（F）可见， 从5 min 到 60 min， 实际计算的 λ_T与理论 λ_T均较为吻合， 即无阴性液滴被识别为假阳性液滴的情况发生.

本文的其它图/表

• Scheme 1  Schematic of droplet based digital detection
• Scheme 2  Syntheses of alkaline phosphatase substrate 7?(dihydroxyphosphoryloxyl) coumarin?4?acetic acid methyl ester(C?4)
• Fig.1  Basic property characterization of 4?MU, C?2, 4?MUP, C?4 and SP?AKP（A） The fluorescence spectra and partition coefficients（lg D） of 4?MU and C?2； （B） the fluorescence intensity standard curves of 4?MU and C?2； （C） the Michaelis?Menten equation of corresponding substrate C?4 and 4?MUP； （D） the catalytic activity comparison of AKP and SP?AKP.The concentrations of AKP and SP?AKP are 1×10^-6 mg/mL and 12.17×10^-6 mg/mL， respectively.
• Fig.2  Characterization of fluorescent product(C?2 and 4?MU) leakage in droplets(A) Fluorescence images of 4?MU in droplets at 0(A₁), 5(A₂), 10(A₃) and 20 min(A₄). (B) Fluorescence images of C?2 in droplets at 0 min (B₁), 30 min (B₂), 60 min (B₃) and 24 h (B₄). Corresponding fluorescence intensity distribution of droplets using 4?MU(C) and C?2(D). Different color indicates different incubation times after droplet generation. (E) Evolution of positive droplet fraction using C?2 and 4?MU over time.The ordinate and horizontal axis indicate the proportion of positive droplets and incubation time, respectively.
• Fig.4  Droplet based digital detection of SP?AKP using 4?MUP and C?4(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) of SP?AKP at λ_T=0.0007(A₁), 0.007(A₂), 0.069(A₃), and 0.312(A₄) using 4?MUP after 10 min incubation. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images (insert pictures) of SP?AKP at λ_T=0.0007(B₁), 0.007(B₂), 0.069(B₃), and 0.312(B₄) using C?4 after 20 min incubation. The experimental λ_Tversus theoretical λ_T using 4?MUP(C) and C?4(E). The ordinate and horizontal axis indicate the experimental λ_T and the theoretical λ_T, respectively. The experimental λ_Tversus SP?AKP concentration using 4?MUP(D) and C?4(F).