水溶性香豆素荧光底物的制备及在液滴数字式检测中的应用 高等学校化学学报    2021, 42 (11): 3537-3546.   DOI:10.7503/cjcu20210459

Scheme 2 Syntheses of alkaline phosphatase substrate 7?(dihydroxyphosphoryloxyl) coumarin?4?acetic acid methyl ester(C?4)

正文中引用本图/表的段落

为验证荧光分子C-2在液滴中的防扩散性能， 以含有2 mmol/L C-2或4-MU的液滴作为初始阳性液滴， 以不含有荧光产物的液滴作为阴性液滴， 将初始阳性液滴与阴性液滴以体积比1∶4混合后通入液滴储存腔中， 并在不同时间点统计阳性液滴和阴性液滴的荧光强度和比例. 将初始阴性液滴荧光分布峰进行高斯拟合， 得到高斯拟合的平均值和标准差， 取平均值加上10倍标准差得到的数值作为阳性/阴性液滴的划分阈值. 由图2（A）， （C）和（E）可见， 4-MU组的液滴在5 min时即出现4-MU从阳性液滴扩散进入阴性液滴的现象， 导致阳性液滴荧光信号降低而阴性液滴荧光信号增强的现象， 从而使部分阴性液滴被误认为阳性液滴； 在第10 min时， 已有60%以上的阴性液滴由于扩散导致的信号增强而被辨别为阳性液滴； 在60 min时， 由于所有液滴均有荧光信号， 阴阳性液滴已无法区分. 与4-MU组相比， C-2组在24 h时仍维持20%的初始阳性液滴比例［图2（B）， （D）和（E）］. 由图2（D）可见， 阴性液滴的荧光强度始终维持在2500以下， 而阳性液滴平均荧光强度维持在15000以上， 阳性/阴性液滴区分显著， 证明C-2在液滴中的防扩散性能显著优于4-MU， 可实现24 h以上的稳定检测及阴性液滴和阳性液滴的准确读取.

已有研究表明， 在以氟化油为油相的液滴体系中， 香豆素染料在液滴中的保留时间与辛醇-水分配系数（lgD）有关， lgD越小的荧光分子在液滴中的保留时间越长， 越不容易扩散［8，9］. 实验中发现， 4-MU和C-2的lgD分别为0.78和0.35， 虽然2种荧光物质均倾向于溶解在油相中， 但是与4-MU相比， C-2的lgD更小， 在液滴中的保留时间更长. 小分子荧光染料C-2和4-MU在氟化油的溶解度较低［19］， 且C-2长时间放置也会引起背景的微弱增强［图2（D）， 放置24 h后背景液滴的荧光强度有所增加］， 可见C-2与 4-MU在氟化油体系中的扩散可能是染料在水油界面的扩散所致［8］. 但由于液滴体系的酶促数字式检测所需时间相对较短， 通常在十几分钟至1小时内均可完成［7］， 在此期间C-2几乎无扩散， 因此C-2对应的碱性磷酸酶底物C-4有望应用于液滴体系的酶促数字式检测中， 从而改善现有4-MU荧光分子扩散的情况.

本文的其它图/表

• Scheme 1  Schematic of droplet based digital detection
• Fig.1  Basic property characterization of 4?MU, C?2, 4?MUP, C?4 and SP?AKP（A） The fluorescence spectra and partition coefficients（lg D） of 4?MU and C?2； （B） the fluorescence intensity standard curves of 4?MU and C?2； （C） the Michaelis?Menten equation of corresponding substrate C?4 and 4?MUP； （D） the catalytic activity comparison of AKP and SP?AKP.The concentrations of AKP and SP?AKP are 1×10^-6 mg/mL and 12.17×10^-6 mg/mL， respectively.
• Fig.2  Characterization of fluorescent product(C?2 and 4?MU) leakage in droplets(A) Fluorescence images of 4?MU in droplets at 0(A₁), 5(A₂), 10(A₃) and 20 min(A₄). (B) Fluorescence images of C?2 in droplets at 0 min (B₁), 30 min (B₂), 60 min (B₃) and 24 h (B₄). Corresponding fluorescence intensity distribution of droplets using 4?MU(C) and C?2(D). Different color indicates different incubation times after droplet generation. (E) Evolution of positive droplet fraction using C?2 and 4?MU over time.The ordinate and horizontal axis indicate the proportion of positive droplets and incubation time, respectively.
• Fig.3  Characterization of 4?MUP and C?4 in droplets over time(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(A₁), 5 min(A₂), 10 min(A₃), and 30 min(A₄) incubation of 4?MUP substrate under λ=0.04. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) after 0 min(B₁), 10 min(B₂), 20 min(B₃), and 60 min(B₄) incubation of C?4 substrate under λ=0.55. Summary of florescence distribution after different incubation time using 4?MUP(C) and C?4(E). Different color indicates different incubation times after droplet generation. The experimental λ of 4?MUP(D) and C?4(F) over time.
• Fig.4  Droplet based digital detection of SP?AKP using 4?MUP and C?4(A) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images(insert pictures) of SP?AKP at λ_T=0.0007(A₁), 0.007(A₂), 0.069(A₃), and 0.312(A₄) using 4?MUP after 10 min incubation. (B) The fluorescence distribution of droplets and fluorescence images (insert pictures) of SP?AKP at λ_T=0.0007(B₁), 0.007(B₂), 0.069(B₃), and 0.312(B₄) using C?4 after 20 min incubation. The experimental λ_Tversus theoretical λ_T using 4?MUP(C) and C?4(E). The ordinate and horizontal axis indicate the experimental λ_T and the theoretical λ_T, respectively. The experimental λ_Tversus SP?AKP concentration using 4?MUP(D) and C?4(F).