一锅法合成去甲基麻黄素

doi:10.7503/cjcu20210078

摘要/Abstract

摘要：

以廉价底物苯甲醛、丙酮酸和NH₄Cl为原料, 通过级联乙醛羟酸合成酶(ASAHⅠ)催化缩合反应和胺脱氢酶(BbAmDH)催化还原胺化反应, 构建了去甲基麻黄素的生物合成新途径. 通过优化分步法和一锅法的反应条件, 使苯甲醛转化率分别达到99%和83%. 采用一锅法, 利用底物补料策略, 有效解除了ASAHI的底物和产物抑制作用, 批次反应的苯甲醛浓度从40 mmol/L提高到100 mmol/L, 苯甲醛转化率从83%提高到90%, 苯甲醛的时空转化率提高了2.7倍.

关键词: 去甲基麻黄素, 一锅法, 生物转化, 乙醛羟酸合成酶, 胺脱氢酶

Abstract:

In this study， a new biosynthetic pathway of norephedrine was constructed， through cascading the carboligation reaction catalyzed by acetohydroxyacid synthase Ⅰ（ASAHI） and reductive amination reaction ca-talysed by amine dehydrogenase（BbAmDH）， the cheap substrate benzaldehyde， pyruvate and NH₄Cl used as raw materials. Optimizing the reaction conditions of the two-step and one-pot method， the conversion rate of benzaldehyde was as high as 99% in the two-step and 83% in one-pot. Utilizing the strategy of feeding in one pot， the substrate and production inhibition effect of ASAHI was successfully relieved， and the benzaldehyde loading was increased to 100 mmol/L from 40 mmol/L in the batch reaction； the benzaldehyde conversion rate was increased to 90% from 83%， and the space-time conversion rate of benzaldehyde was increased by 2.7 times.

Key words: Norephedrine, One-pot, Biotransformation, Acetohydroxyacid synthase I, Amine dehydrogenase

中图分类号:

O621.2

TrendMD:

罗磊, 穆晓清, 吴涛, 聂尧, 徐岩. 一锅法合成去甲基麻黄素. 高等学校化学学报, 2021, 42(8): 2458.

LUO Lei, MU Xiaoqing, WU Tao, NIE Yao, XU Yan. Synthesis of Norephedrine in One Pot. Chem. J. Chinese Universities, 2021, 42(8): 2458.

图/表 9

Scheme 1 Cascade reaction of synthetizing norephedrine catalyzed by the ASAHI and BbAmDH

Fig.1 SDS?PAGE analysisM： protein marker； lanes 1 and 2： crude enzyme/cell-free extracts for ASAHI； lanes 3 and 4： crude enzyme/cell-free extracts for BbAmDH； lanes 5 and 6： purified BbAmDH/ BbAmDHK78S/N276C.

Fig.2 Optimization of the enzymatic production of R?PAC（A） pH=7.0；（B） 30 ℃；（C） pH=7.0， 30 ℃；（D） pH=7.0， 30 ℃. Reaction conditions： 100 mmol/L PBS buffer， 5 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L ThDP， 0.5 mmol/L DTT， 80 mmol/L pyruvate， 10% DMSO and 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAHI.

Fig.3 Carboligation of BA with pyruvate by E.coli BL21(DE3)/pET?28a?ASAHIReaction conditions： 100 mmol/L PBS buffer（pH=7）， 5 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L ThDP， 0.5 mmol/L DTT， 80 mmol/L pyruvate， 10% DMSO（volume fraction）， 40 mmol/L benzaldehyde， 30 ℃ and 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAHI.

Fig.4 Optimization of the enzymatic production of norephedrine（A） pH=9.5；（B） 40 ℃. Reaction conditions： 37 mmol/L R-PAC， 0.7 mol/L NH4Cl， 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C.

Fig.5 Enzymatic production of norephedrine in the two stepsReaction conditions of step 1： 100 mmol/L PBS buffer（pH=7）， 5 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L ThDP， 0.5 mmol/L DTT， 80 mmol/L pyruvate， 10% DMSO（volume fraction）， 40 mmol/L benzaldehyde， 30 ℃ and 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAHI； step 2： NH4Cl/NH3H2O buffer（0.7 mol/L， pH=9.5） 37 mmol/L R-PAC， 40℃ and 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C.

Fig.6 Optimization of the enzymatic production of norephedrine in one?pot（A） 40 ℃， 0.7 mol/L NH4Cl；（B） 40 ℃， pH=8.5. Reaction conditions： 5 mmol/L MgCl2， 1 mmol/L ThDP， 0.5 mmol/L DTT， 80 mmol/L pyruvate， 10% DMSO（volume fraction）， 40 mmol/L benzaldehyde， 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAHI and 60mg/mL E .coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C.

Fig.7 Enzymatic production of norephedrine in one?potReaction conditions： 40 mmol/L benzaldehyde+80 mmol/L pyruvate+0.7 mol/L NH4Cl+5 mmol/L MgCl2+1 mmol/L ThDP+0.5 mmol/L DTT+10% DMSO（volume fraction）+60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAHI， 40 ℃， pH=8.5 and 60mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C.

Fig.8 The one?pot enzymatic production of norephedrine in fed?batchReaction conditions： 5 mmol/L MgCl2+1 mmol/L ThDP+0.5 mmol/L DTT+80 mmol/L pyruvate+10% DMSO+ 40 mmol/L benzaldehyde+0.7 mol/L NH4Cl， 40 ℃， pH=8.5， 60 mg/mL E .coli BL21（DE3）/pET-28a-ASAHI and 60 mg/mL E. coli BL21（DE3）/pET-28a-BbAmDHK78S/N276C. Feeding strategy： feeding of 30 mmol/L benzaldehyde and 30 mmol/L pyruvate every 4 h.

参考文献 32

1	Krizevski R.， Dudai N.， Bar E.， Lewinsohn E.， J. Ethnopharmacol， 2007， 114（3）， 432—438
2	Ghorab M. M.， Alqasoumi S. I.， Abdel⁃Kader M. S.， Alsaid M. S.， Acta Pol. Pharm.， 2014，71（4） 615—623
3	Kim D. J.， Cho B. T.， B. Korean Chem. Soc.， 2003， 24（11） 1641—1648
4	Correia C. A.， Gilmore K.， Mcquade D. T.， Seeberger P. H.， Angew. Chem. Int. Edit， 2015， 54（16）， 4945—4948
5	American Chemical Society SciFinder^®， https：//scifinder.cas.org/scifinder/view/scifinder/scifinder Explore.jsf
6	Gonzalez⁃Juarez D. E.， Escobedo⁃Moratilla A.， Flores J.， Hidalgo⁃Figueroa S.， Martinez⁃Taguena N.， Morales⁃Jimenez J.， Muniz⁃Ramirez A.， Pastor⁃Palacios G.， Perez⁃Miranda S.， Ramirez⁃Hernandez A.， Trujillo J.， Bautista E.， Molecules， 2020， 25（14）， 3283
7	Krizevski R.， Bar E.， Shalit O.， Sitrit Y.， Ben⁃Shabat S.， Lewinsohn E.， Phytochemistry， 2010， 71（8/9）， 895—903
8	Gocke D.， Graf T.， Brosi H.， Frindi⁃Wosch I.， Walter L.， Mueller M.， Pohl M.， J. Mol. Catal. B⁃Enzym， 2009， 61（1/2）， 30—35
9	Sehl T.， Bock S.， Marx L.， Maugeri Z.， Walter L.， Westphal R.， Vogel C.， Menyes U.， Erhardt M.， Mueller M.， Pohl M.， Rother D.， Green Chemistry， 2017， 19（2）， 380—384
10	Wu X.， Fei M. D.， Wang Z. Q.， Chen， Y. J.， Chen Y.， Appl. Microbiol. Biot.， 2014， 98（17）， 7399—7408
11	Lee Y. C.， Chen Y. Y.， Lin J. S. Chen Y. W.， Liang K. X.， Chan H. H.， Lin W. D.， Kao C. H.， Process Biochem.， 2018， 73， 74—81
12	Li H.， Liu N.， Hui X.， Gao W. Y.， RSC Adv.， 2017， 7（52）， 32664—32668
13	Shanati T.， Lockie C.， Beloti L.， Grogan G.， Ansorge⁃Schumacher M. B.， ACS Catalysis， 2019， 9（7）， 6202—6211
14	Lee H. K.， Kang S.， Choi E. B.， J. Org. Chem.， 2012， 7（12）， 5454—5460
15	Groeper J. A.， Hitchcock S. R.， Ferrence G. M.， Tetrahedron⁃Asymmetry， 2006， 17（20）， 2884—2889
16	Sehl T.， Hailes H. C.， Ward J. M.， Wardenga R.， von Lieres E.， Offermann H.， Westphal R.， Pohl M.， Rother D.， Angew. Chem. Int. Ed.， 2013， 52（26）， 6772—6775
17	Sehl T.， Hailes H. C.， Ward J. M.， Menyes U.， Pohl M.， Rother D.， Green Chemistry， 2014， 16（6）， 3341—3348
18	Mathew S.， Yun H.， ACS Catalysis， 2012， 2， 993—1001
19	Kelly S. A.， Pohle S.， Wharry S.， Mix S.， Allen Christopher C. R.， Moody Thomas S.， Gilmore Brendan F. ， Chem. Rev.， 2018， 118（1）， 349—367
20	Mangas⁃Sanchez J.， France S. P.， Montgomery S. L.， Aleku G. A.， Man H.， Sharma M.， Ramsden J. I.， Grogan G.， Turner N. J.， Curr. Opin. Chem. Biol.， 2017， 37， 19—25
21	Lenz M.， Borlinghaus N.， Weinmann L.， Nestl B. M.， World J. Microb. Biot.， 2017， 33（11）， 199
22	Cosgrove S. C.， Brzezniak A.， France S. P.， Ramsden J.I.， Mangas⁃Sanchez J.， Montgomery S. L.， Heath R. S.， Turner N. J.， Methods in Enzymology， 2018， 608， 131—149
23	Patil M.D.， Grogan G.， Bommarius A.， Yun H.， ACS Catalysis， 2018， 8（12）， 10985—11015
24	Wu T.， Mu X. Q.， Nie Y.， Xu Y.， Chem. J. Chinese Universities， 2019， 41（5）， 1018—1025（吴涛，穆晓清，聂尧，徐岩. 高等学校化学学报， 2019， 41（5）， 1018—1025）
25	Lauchli R.， Rabe K. S.， Kalbarczyk K. Z.， Tata A.， Heel T.， Kitto R. Z.， Arnold FH.， Angew. Chem. Int. Edit.， 2013， 52（21）， 5571—5574
26	Reetz M. T.， J. Am. Chem. Soc.， 2013， 135（34）， 12480—12496
27	Abrahamson M. J.， Vazquez⁃Figueroa E.， Woodall N. B.， Moore J. C.， Bommarius A. S.， Angew. Chem. Int. Edit.， 2012， 51（16）， 3969—3972
28	Abrahamson M. J.， Wong J. W.， Bommarius A. S.， Adv. Synth. Catal.， 2013， 355， 1780—1786
29	Liu L.， Wang D. H.， Chen F. F.， Zhang Z. J.， Chen Q.， Xu J. H.， Wang Z. L.， Zheng G.W.， Catal. Sci.Technol.， 2020，10（8）， 2353—2358
30	Deventer K.， Pozo O. J.， van Eenoo P.， Delbeke F. T.， J. Chromatogr. B.， 2009， 877（4）， 369—374
31	Bruder S.， Boles E.， Biochem. Eng. J.， 2017， 120， 103—112
32	Xu C.， Yin X.， Zhang C.， Chen H.， Huang H.， Hu Y.， Chem. Res. Chinese Universities， 2018， 34（2）， 279—284

[1]	杨兆华, 成鸿静, 杨弋, 刘辉, 杜飞鹏, 张云飞. 聚乙烯醇载银海绵的制备及界面光热驱动水蒸发性能[J]. 高等学校化学学报, 2022, 43(10): 20220181.
[2]	吴涛,穆晓清,聂尧,徐岩. 迭代饱和突变提高Bacillus cereus胺脱氢酶对苯乙酮还原的催化效率[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(5): 1018.
[3]	曹锰, 柳阳, 张尚玺, 王振希, 徐胜. 壳聚糖钴配合物的合成及光催化产氢性能[J]. 高等学校化学学报, 2020, 41(4): 735.
[4]	杜晨晖, 李泽, 崔小芳, 张敏, 裴香萍, 詹海仙, 闫艳. 基于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS技术研究酸枣仁发酵过程中的化学成分转化[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(8): 1614.
[5]	韩铭鑫, 李方彤, 张琰, 戴雨霖, 郑飞, 越皓. 稀有原人参二醇型皂苷的人肠道菌群生物转化[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(7): 1390.
[6]	肖永坤, 刘春莹, 鱼红闪, 李泰厚, 徐龙权, 宋建国, 林完泽, 孙长凯, 金凤燮. 人参二醇类皂苷的生物转化动态及人参稀有皂苷C-K或F₂的制备[J]. 高等学校化学学报, 2019, 40(6): 1184.
[7]	崔思乾, 卢俊瑞, 谢志强, 卢博为, 刘金彪, 刘梅, 马瑶, 胡新龙, 李贾东. 吡唑并[2,3-c]吡喃酮衍生物的一锅法熔融合成[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(4): 688.
[8]	乔梦丹, 刘尚, 张琰, 李晶, 郑飞, 戴雨霖, 越皓. 基于UPLC-Q-Orbitrap MS/MS研究人参皂苷在发酵过程中的生物转化[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(2): 219.
[9]	刘欣茹, 刘春莹, 徐龙权, 宋建国, 鱼红闪. 人参皂苷β-葡萄糖苷酶基因的毕赤酵母载体构建及生物转化[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(11): 2451.
[10]	张金, 史天彩, 罗力文, 刘佳, 刘荣, 刘乐, 梁明, 马养民. 纳米氧化铜催化一锅法合成β-咔啉类化合物[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(11): 2411.
[11]	李瑞刚, 朱娜, 赵幻希, 王楠, 孙红梅, 越皓, 李晶. 人参多糖对人参皂苷Re体内代谢和体外转化的影响[J]. 高等学校化学学报, 2018, 39(10): 2192.
[12]	刘豫龙, 路芳, 路萍. 基于芘并咪唑的电致发光材料的合成与表征[J]. 高等学校化学学报, 2017, 38(4): 583.
[13]	李男, 赵幻希, 李晶, 王楠, 于渤浩, 越皓, 于珊珊. 重组内切纤维素酶Fpendo5A转化三七总皂苷[J]. 高等学校化学学报, 2017, 38(12): 2185.
[14]	张金, 刘佳, 马养民, 杨秀芳, 程佩, 范超, 卢萍. 纳米TiO₂催化一锅法合成喹唑啉酮并酞嗪酮及3-酰胺基异吲哚酮并喹唑啉酮类化合物[J]. 高等学校化学学报, 2016, 37(9): 1629.
[15]	许春春, 于渤浩, 王红蕾, 李晶, 刘淑莹, 于珊珊. 重组嗜热β-葡萄糖苷酶转化稀有人参皂苷Rd和CK[J]. 高等学校化学学报, 2016, 37(2): 281.