纳米孔道单分子技术检测寡核苷酸定制样品中的杂质

doi:10.7503/cjcu20260314

摘要/Abstract

Abstract:

Conventional methods mainly rely on ensemble-averaged bulk characterization， which remains challenging for identifying low-abundance endogenous impurities generated during synthesis. Here， we developed a biological nanopore-based single-molecule strategy for the direct detection of truncated-sequence impurities in customized oligonucleotide samples. Using an aerolysin nanopore to analyze a customized poly（dA）₉ sample， we observed three clearly distinguishable characteristic peaks in the nanopore current fingerprint spectrum. Among them， the peaks with smaller current blockages matched those of poly（dA）₄ and poly（dA）₃， indicating the presence of additional oligonucleotide species besides the target product. In addition， the relative peak area ratios remained nearly constant over the data acquisition period from 0.5 to 10 min， demonstrating that this method can provide stable impurity signals within 1 min and enable rapid analysis of sample compositional heterogeneity. This study expands the application of nanopore technology in the quality evaluation of real biomolecular products and offers a single-molecule analytical strategy for impurity detection in oligonucleotides and other biomolecules.

Key words: Nanopore, Single-molecule detection, Customized oligonucleotide, Impurity analysis

中图分类号:

O657

TrendMD:

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图/表 3

Fig.1 Single⁃molecule detection of the customized poly(dA)9 sample using the Aerolysin nanopore（A） Schematic illustration of single-molecule sensing based on the Aerolysin nanopore；（B） representative ionic current signals generated by poly（dA）9 translocation through the nanopore；（C） current histogram（upper panel） and I/I0vs. tD scatter plot（lower panel） of the customized poly（dA）9 sample. Gaussian fitting of the current distribution revealed three characteristic peaks， designated P1， P2 and P3. The concentration of the customized poly（dA）9 oligonucleotide sample was fixed at 4 μmol/L.

Fig.2 Time⁃dependent current distributions of single⁃molecule signals from the customized poly(dA)9（A—E） Current histograms and I/I0vs. tD scatter plots of single-molecule signals acquired at recording time of 0.5， 1， 2， 5， and 10 min， respectively. Each point in scatter plot represents a single-molecule blockade event；（F） relative peak area ratios of the three characteristic peaks obtained at different recording time.

Fig.3 Identification of endogenous short⁃chain impurities in the customized poly(dA)9 sample（A—C） Representative ionic current traces， current histograms， and I/I0vs. tD scatter plots of an individual poly（dA）4 sample and a mixed sample of poly（dA）4 and poly（dA）9；（D—F） representative ionic current traces， current histograms， and I/I0vs. tD scatter plots of an individual poly（dA）3 sample and a mixed sample of poly（dA）3 and poly（dA）9. The concentrations of the customized poly（dA）4 and poly（dA）3 oligonucleotide samples were both fixed at 2 μmol/L.

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