基于锌配合物的一氧化氮荧光探针的构建及其细胞成像

doi:10.7503/cjcu20240370

摘要/Abstract

摘要：

合成了一种基于锌配合物检测NO的荧光探针CMD-Zn²⁺. 以萘并呋喃酰肼和久洛尼定醛为原料, 经缩合反应制备了配体CMD, 再将它与锌离子结合形成探针CMD-Zn²⁺, 该探针可特异性识别NO. 利用高分辨率质谱(HRMS)和核磁共振氢谱(¹H NMR)对CMD的结构进行了表征, 利用荧光光谱和紫外-可见吸收光谱考察了探针CMD-Zn²⁺对NO的识别性能. 实验结果表明, 在其它竞争离子存在的情况下, 探针CMD-Zn²⁺可特异性快速识别NO, 响应时间为30 s, 识别NO的检出限为8.23×10^‒9 mol/L. 此外, 探针CMD-Zn²⁺被成功应用于细胞和活鼠的荧光成像研究.

关键词: 荧光探针, 锌配合物, 一氧化氮, 细胞成像, 小鼠成像

Abstract:

A fluorescent probe CMD-Zn²⁺ based on zinc complexes was constructed for NO detection， Ligand CMD was prepared by naphthalene and furanide and ligonidaldehyde by condensation reaction. The ligand CMD was combined with zinc ions to form the probe CMD-Zn²⁺. The probe CMD-Zn²⁺ could specifically recognize NO. The recognition performance of probe CMD-Zn²⁺ was examined by fluorescence spectroscopy and UV absorption spectroscopy， and the structure of CMD was characterized by high-resolution mass spectroscopy（HRMS） and nuclear magnetic resonance hydrogen spectroscopy（¹H NMR）. The experimental results showed that in the presence of other competing ions， the probe CMD-Zn²⁺ specifically recognized NO， and the detection limit of NO recognition was 8.23×10^‒9 mol/L. The probe CMD-Zn²⁺ has been successfully applied in fluorescence imaging studies in cells and live mice.

Key words: Fluorescent probe, Zinc complex, NO, Cell imaging, Live mouse imaging

中图分类号:

TrendMD:

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图/表 10

Fig.1 Fluorescence titration spectra of Zn2+(0—20 µmol/L) identified by CMD(10 µmol/L)(A) and fluorescence response of CMD(10 μmol/L) with concentration of Zn2+(0—12 µmol/L)(B)（A） Inset： fluorescence intensity of CMD with the concentration of Zn2+；（B） λex=435 nm， λem=540 nm.

Fig.2 UV⁃Vis spectra of probe CMD⁃Zn2+(10 μmol/L) to different anions and 30 μmol/L small biological molecules(Pi, PPi, H2O2, NO2‒ , NO3‒ , OH, O·2 ‒, NO, Hcy, GSH, Cys, DHA and ONOO‒)

Fig.3 Fluorescence spectra of 10 μmol/L CMD⁃Zn2+ upon common anions and 30 μmol/L small biological molecules(Pi, PPi, H2O2, NO2‒ , NO3‒ , ‧OH, O·2 ‒, NO, Hcy, GSH, Cys, DHA and ONOO‒)(A) and fluorescence color of probe CMD(10 μmol/L) and the addition of 13 anions and 30 μmol/L small biological molecules to 10 μmol/L CMD⁃Zn2+(B)（B） 1. CMD； 2. blank； 3. NO； 4. NO2‒ ； 5. NO3‒ ； 6. H2O2； 7. ONOO‒； 8. ‧OH； 9. O·2‒； 10. Cys； 11. Hcy； 12. GSH； 13. Pi； 14. DHA； 15. PPi； 30 μmol/L.

Fig.4 Fluorescence spectra of the 10 µmol/L probe CMD⁃Zn2+ towards 0—30 µmol/L NO(A) and fluorescence spectra of 20 μmol/L Zn2+ and 30 μmol/L NO identified by 10 μmol/L probe CMD relay(B)（A） Inset： fluorescence intensity of CMD-Zn2+ varies with NO concentration.

Fig.5 Fluorescence intensity of adding 30 μmol/L NO to 10 μmol/L probe CMD⁃Zn2+ solution containing competing ions1. Pi； 2. PPi； 3. H2O2； 4. NO2‒； 5. NO3‒； 6. ·OH； 7. O·2‒； 8. NO； 9. Hcy； 10. GSH； 11. Cys； 12. DHA； 13. ONOO‒.

Fig.6 Fluorescence intensity of 10 μmol/L CMD⁃Zn2+ as a function of NO concentration(3—13 μmol/L)λex=435 nm， λem =575 nm.

Fig.7 Fluorescence intensity of the probe CMD⁃Zn2+(10 μmol/L) before and after the addition of 30 μmol/L NO at different pH values in DMF/HEPES(volume ratio 3∶7, 20 mmol/L)(λex=435 nm, λem=575 nm)(A) and the response time of probe CMD⁃Zn2+(10 μmol/L) solution to 30 μmol/L NO(B)

Fig.8 Viability of HeLa cells incubated with 30 μmol/LCMD⁃Zn2+ for 24 h

Fig.9 Confocal fluorescence images of 20 μmol/L Zn2+ and 30 μmol/L NO identified by 10 μmol/L CMD（A1）—（C1） CMD；（A2）—（C2） CMD-Zn2+；（A3）—（C3） CMD-Zn2+-NO；（A1）—（A3） bright field；（B1）—（B3） blue channel；（C1）—（C3） merge.

Fig.10 Fluorescence imaging of exogenous recognition of NO by probe CMD⁃Zn2+ in mice(A) and the average fluorescence intensity of Zn2+ and NO detected by CMD in mice(λex=435 nm, λem=575nm)(B)（A1） Blank control group；（A2） CMD（10 μmol/L， 100 μL） was subcutaneously injected into the left abdomen of the mice； the fluorescence images recorded by subcutaneous injection of Zn2+（5 mmol/L， 25 μL） into the same interest area of mice at 30 s（A3）， 60 s（A4）， 90 s（A5）， and 120 s（A6）； the fluorescence images of continued injection of NO（2 mmol/L， 25 μL） in situ were recorded at 1 min（A7）， 2 min（A8）， 3 min（A9） and 4 min（A10）.

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