肠道共生菌Akkermansia muciniphila编码的重组蛋白Amuc_0119的表达与纯化

doi:10.7503/cjcu20250283

摘要/Abstract

摘要：

粘蛋白降解肠道共生菌Akkermansia muciniphila因具有促进健康的效用而备受关注, 其蛋白组分在宿主-微生物互作中发挥着重要作用. 其中, Amuc_0119是一类尚未表征的假定蛋白, 具有潜在生物学功能. 本文旨在构建Amuc_0119的重组表达系统, 以促进其结构和功能研究. 将Amuc_0119编码序列克隆至N端和C端均带有6×His标签的pET-28a(+)载体中, 并转化至大肠杆菌BL21(DE3). 在37 ℃下以0.5 mmol/L IPTG过夜诱导表达, 经SDS-PAGE分析获得了46 kDa重组蛋白, 并通过Ni-NTA亲和层析纯化, 其纯度达92.08%. Western blot结果确认为目标蛋白, 通过BCA定量测得最终浓度为818.44 μg/mL. 本文建立了Akkermansia muciniphila来源Amuc_0119的高效表达与纯化体系, 为后续结构及功能研究提供了必要工具.

关键词: 粘蛋白降解肠道共生菌(Akkermansia muciniphila), 益生菌, Amuc_0119, 表达, 纯化

Abstract:

The mucin-degrading gut commensal bacterium Akkermansia muciniphila has emerged as a promising probiotic due to its significant health-promoting effects， wherein its protein constituents mediate critical host-microbe crosstalk. Notably， Amuc_0119 represents an uncharacterized protein potentially with beneficial biological functions. In this study， we aimed to construct an expression system for recombinant Amuc_0119 to facilitate its structural and functional characterization. The coding sequence of Amuc_0119 was cloned into pET-28a（+） vector with an N-terminal 6×His-tag and successfully transformed into E. coli BL21（DE3） competent cells. Protein expression was induced by 0.5 mmol/L IPTG overnight at 37 °C. SDS-PAGE analysis revealed successful expression of the 46 kDa recombinant protein， which was subsequently purified via Ni-NTA affinity chromatography with a purity of 92.08%. Western blot with anti-His antibodies confirmed the target protein identity， while quantitative BCA assay determined a final concentration of 818.44 μg/mL. This study establishes the first efficient expression and purification protocol for Akkermansia muciniphila-derived Amuc_0119， providing essential tools for forthcoming structural studies and functional investigations for this bacterial protein.

Key words: Akkermansia muciniphila, Probiotic, Amuc_0119, Expression, Purification

中图分类号:

Q554

TrendMD:

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图/表 6

Table 1 Biochemical parameters of Amuc_0119

Number of amino acid residues	439	Percentage of the top three high amino acids	Ala（10.7%）， Ser（8.4%）， Pro（8.2%）
Molecular formula	C₂₁₂₈H₃₃₀₁N₅₉₅O₆₃₆S₁₇	Protein instability index	52.22
Theoretical molecular weight（Da）	47941.24	Fat coefficient	75.85
Theoretical isoelectric point（pI）	6.72	Total average hydrophilicity	-0.333

Fig.1 Biochemical information of Amuc_0119（A） Amuc_0119 hydrophilic-hydrophobic intuitive diagram；（B） Signal peptide of Amuc_0119；（C） Domain and functional site analysis of Amuc_0119；（D） Homology analysis of Amuc_0119；（E） The transmembrane helical structure of Amuc_0119；（F） Three-dimensional structure of Amuc_0119.

Table 2 Subcellular localization of Amuc_0119*

Location weight	Score
Location weight	NNets	Pentamers	Integral
Cytoplasmic	0	0	0
Membrane	0.18	0	0
Secreted	2.37	3.44	10.00
Periplasmic	0.46	0	0

Fig. 2 Construction and transformation of plasmid（A） Comparison of three-dimensional structures；（B） Plasmid map of pET-28a（+）-Amuc_0119（49-1320）；（C） The result of sequence alignment（Amuc_0119-Original sequence； Amuc_0119*-Optimized sequence）.

Fig.3 SDS⁃PAGE analysis of expression and purification of recombinant Amuc_0119Lane M： protein marker； Lane 1： Before induction； Lane 2： After induction； Lane 3： Supernatant after crushing； Lane 4： Precipitation after crushing； Lane 5： Flowing liquid； Lane 6： 10 mmol/L imidazole eluent； Lane 7： 100 mmol/L imidazole eluent； Lane 8—10： 250 mmol/L imidazole eluent.

Fig.4 Western blot analysis of the recombinant Amuc_0119All three lanes are Amuc_0119. Primary Antibody： Anti-His Rabbit Monoclonal Antibody； Secondary Antibody： HRP-labeled Goat Anti-Rabbit IgG （H+L）.

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