柞蚕蛹表达人促红细胞生成素的糖基化修饰分析

doi:10.7503/cjcu20240479

高等学校化学学报 ›› 2025, Vol. 46 ›› Issue (4): 20240479.doi: 10.7503/cjcu20240479

柞蚕蛹表达人促红细胞生成素的糖基化修饰分析

刘晓黎¹, 刘宇博¹^,², 李学臣³, 陈秋实³^,⁴, 范琦⁵, 张嘉宁¹, 李文利¹()

^1.大连理工大学生命科学与药学系，盘锦 124221
^2.大连理工大学生物智能制造教育部重点实验室，大连 116023
^3.香港大学化学系，合成化学国家重点实验室，香港特别行政区 999077
^4.合成化学暨分子生物学有限公司，香港科学园，香港特别行政区 999077
^5.辽宁省海洋水产科学研究院，大连 116023

收稿日期:2024-10-23 出版日期:2025-04-10 发布日期:2024-12-31
通讯作者: 李文利 E-mail:biolwl@dlut.edu.cn
基金资助:
国家自然科学基金(32171282);中央高校基本科研业务费(DUT23YG114)

Analysis of Glycosylation Modification of Human Erythropoietin Expressed in Pernyi Pupae

LIU Xiaoli¹, LIU Yubo¹^,², LI Xuechen³, CHEN Qiushi³^,⁴, FAN Qi⁵, ZHANG Jianing¹, LI Wenli¹()

^1.School of Life and Pharmaceutical Sciences，Dalian University of Technology，Panjin 124221，China
^2.Key Laboratory of Bio?Intelligent Manufacturing，Ministry of Education，Dalian University of Technology，Dalian 116023，China
^3.Department of Chemistry，State Key Laboratory of Synthetic Chemistry，the University of Hong Kong，Hong Kong SAR 999077，China
^4.Laboratory for Synthetic Chemistry and Chemical Biology Limited，Hong Kong Science Park，Hong Kong SAR 999077，China
^5.Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian 116023，China

Received:2024-10-23 Online:2025-04-10 Published:2024-12-31
Contact: LI Wenli E-mail:biolwl@dlut.edu.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China(32171282);the Fundamental Research Funds for the Central Universities, China(DUT23YG114)

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摘要/Abstract

摘要：

利用DNA重组技术在柞蚕蛹中表达重组人促红细胞生成素(Recombinant human erythropoietin， rhEPO)，经过亲和层析纯化后，用SDS-PAGE分离纯化各组分，并通过电喷雾电离串联质谱技术(ESI-MS/MS)检测其糖基化修饰. 结果显示，在柞蚕蛹中表达的rhEPO比活性约为1190 U/μg，其糖基化修饰位点与人体表达的EPO一致，有3个N-糖基化位点和1个O-糖基化位点. 凝集素杂交实验结合质谱结果表明，柞蚕蛹表达的rhEPO的糖链中缺乏唾液酸修饰, 而缺少唾液酸修饰的EPO通过鼻腔给药后在多种神经系统疾病的治疗中发挥着重要的作用. 所得结果为进一步研究外源蛋白在柞蚕蛹-柞蚕核型多角体病毒(Anthraea pernyi nucleopolyhedrorirus, ApNPV)宿主载体表达系统表达后的糖基化与生物活性提供了依据.

关键词: 电喷雾质谱, 促红细胞生成素, 柞蚕蛹, 糖基化

Abstract:

Recombinant human erythropoietin（rhEPO） was expressed in pernyi pupae using DNA recombination technology and gel purified. The purified components were separated by SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）， and the rhEPO gel strips were cut and its glycosylation modification was detected by electrospray ionization tandem mass spectrometry（ESI-MS/MS）. The mass spectrometry results showed that the glycosylation modification sites of rhEPO expressed in pernyi silkworm pupae were consistent with EPO expressed in humans， with three N-glycosylation sites and one O-glycosy-lation site. Although the specific sugar chains at the glycosylation sites cannot be determined based on ESI-MS/MS， its results combined with lectin experiments can help determine the specific sugar chains at the glycosylation modification sites. According to the results， the overall sugar chain lacks sialic acid modification. The results of cell experiments showed that rhEPO expressed by pernyi pupae had certain biological activity， with a specific activity of 1190 U/μg. Therefore， pernyi pupae can express rhEPO without sialic acid modification with certain biological activity， and low sialylated EPO can play an important role in the treatment of central nervous system diseases after nasal administration. The results provide a basis for further studying the glycosylation and biological activity of exogenous proteins after expression in the pernyi pupae-Anthraea pernyi nucleopolyhedrorirus（ApNPV） host vector expression system.

Key words: Electrospray ionization mass spectrometry（ESI-MS/MS）, Erythropoietin, Pernyi pupae, Glycosylation

中图分类号:

TrendMD:

刘晓黎, 刘宇博, 李学臣, 陈秋实, 范琦, 张嘉宁, 李文利. 柞蚕蛹表达人促红细胞生成素的糖基化修饰分析. 高等学校化学学报, 2025, 46(4): 20240479.

LIU Xiaoli, LIU Yubo, LI Xuechen, CHEN Qiushi, FAN Qi, ZHANG Jianing, LI Wenli. Analysis of Glycosylation Modification of Human Erythropoietin Expressed in Pernyi Pupae. Chem. J. Chinese Universities, 2025, 46(4): 20240479.

图/表 8

Fig.1 Transfection of ApNPV⁃bacmid⁃EPO observed under a microscope（A） White light microscope；（B） fluorescence microscope. Cells were derived from hemolymph of pernyi pupa 15 d after infection with ApNPV⁃bacmid-EPO.

Fig.2 Expression of rhEPO protein in pernyi pupae analyzed by SDS⁃PAGE and Western blot（A） Coomassie Brilliant Blue（CBB） stained gel（12%）；（B） Western-blot（His antibody）. Lane 1： protein marker； lane 2： healthy pernyi pupal protein； lane 3： pernyi pupal protein of the infected vector； lanes 4 and 5： pernyi pupal protein infected with EPO recombinant vector. Two rhEPO bands were detected between 25 and 35 kDa in lanes 4 and 5（arrow head ）.

Fig.3 Analysis of purified rhEPO by SDS⁃PAGE and Western blotting（A） Coomassie Brilliant Blue（CBB）-stained gel（12%）；（B） Western-blot（His antibody）. Lane 1： protein marker； lane 2： no purified fraction（all proteins of hemolymph of pernyi pupa）； lane 3： flow-through fraction； lanes 4—8（number 1—5）： purified rhEPO. Two bands were clearly observed between 25 and 35 kDa in lanes 6 and 7（number 3 and 4）， indicating rhEPO.

Fig.4 Quantification and activity of purified rhEPO（A） Human EPO ELISA standard curve. Each concentration of the standard substance was tested in triplicate to generate the standard curve. The absorbance of purified rhEPO（stored in 50% glycerol） at 450 nm（A450） was measured after a 59-fold dilution， yielding a value of 0.270. By interpolating this absorbance into the standard curve， the concentration of rhEPO protein prior to dilution was calculated to be 1.6 mg/mL. （B） Proliferation curve of TF-1 cells stimulated by rhEPO. As the concentration of rhEPO increased， the proliferation rate of TF-1 cells rose sharply. However， when the rhEPO concentration reached 10 ng/mL， the proliferation rate plateaued. These results demonstrated that rhEPO possessed biological activity in vitro. The bioactivity of rhEPO was further estimated based on the relationship between cytokines and ED50， though precise bioactivity values require additional experiments for confirmation.

Fig.5 Lectin⁃blot of rhEPO（A） ConA Lectin-blot； lane 1： protein marker； lane 2： no purified fraction（all proteins of hemolymph of pernyi pupa）； lane 3： flow-through fraction； lanes 4—7（number 1—4）： purified rhEPO. （B） VVL Lectin-blot. （C） WGA Lectin-blot. （D） AAL Lectin-blot； lane 1： protein marker； lane 2 ： purified rhEPO； lane 3： no purified fraction（all proteins of hemolymph of pernyi pupae）.

Fig.6 N⁃glycosylation modification of rhEPO in pernyi pupae（A） Secondary mass spectrum of HexNAc2Hex3Fuc at Asn48；（B） secondary mass spectrum of HexNAc2Hex3 at Asn62；（C） secondary mass spectrum of HexNAc2Hex2Fuc at Asn107.

Fig.7 O⁃glycosylation modification of rhEPO in pernyi pupae

Table 1 Glycan components by ESI-MS/MS

N⁃glycosylation sites	N⁃glycan component
Asn48	HexNAc2Hex2	HexNAc2Hex2Fuc	HexNAc2Hex3	HexNAc2Hex3Fuc
Asn62	HexNAcFuc	HexNAc2HexFuc	HexNAc2Hex2Fuc	HexNAc2Hex3Fuc
Asn62	HexNAc2Hex	HexNAc2Hex2	HexNAc2Hex3
Asn107	HexNAcFuc	HexNAc2Hex2Fuc2	HexNAc2Hex5Fuc	HexNAc3Hex4
	HexNAc2Hex	HexNAc2Hex3	HexNAc2Hex6	HexNAc3Hex4Fuc
	HexNAc2HexFuc	HexNAc2Hex3Fuc	HexNAc2Hex7	HexNAc3Hex5Fuc2
	HexNAc2HexFuc2	HexNAc2Hex3Fuc2	HexNAc3Hex3	HexNAc4Hex3Fuc
	HexNAc2Hex2	HexNAc2Fuc	HexNAc3Hex3Fuc	HexNAc2Hex2Fuc
	HexNAc2Hex4Fuc	HexNAc3Hex3Fuc2	HexNAc2Hex4	HexNAc2Hex5

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柞蚕蛹表达人促红细胞生成素的糖基化修饰分析

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