芘二聚体发夹探针用于细胞DNA单链断裂修复能力的评估

doi:10.7503/cjcu20230288

摘要/Abstract

摘要：

基于芘分子二聚体的荧光特性设计了一种新型的发夹探针, 用于评估不同细胞的单链断裂修复(SSBR)能力. 首先利用芘荧光分子设计一个茎上有缺口的DNA发夹探针, 该探针在Bst DNA聚合酶作用下可以水解, 使荧光信号“关闭”. 如果探针茎上的缺口被DNA修复酶修复, 可以阻止Bst DNA聚合酶对探针的消化作用, 从而阻止荧光信号的“关闭”. 该设计可以用于评估细胞的SSBR能力, 并通过提取细胞的核蛋白考察了不同细胞的SSBR能力. 研究结果表明, 肿瘤细胞及细胞系不具有原代细胞的SSBR能力. 利用SSBR的关键酶进一步探索了肿瘤细胞SSBR能力缺失的原因, 证明是由于肿瘤细胞中含有可以抑制SSBR过程的活性物质. 此外, 该方法能够同时进行500个细胞的SSBR能力检测, 并用于抗衰老药物筛选.

关键词: 单链断裂修复, 芘二聚体, 发夹探针, 原代细胞, 肿瘤细胞

Abstract:

A novel pyrene excimer-based hairpin probe with a nick at the stem was developed to directly evaluate the single-strand break repair（SSBR） ability. In the existence of appropriate activity of DNA repair-associated enzymes（DREs）， the oligonucleotide probe could prevent the digestion of Bst DNA polymerase and keep the long-wavelength excimer signal. However， in the absence of DREs， the nicked probe could be digested by Bst DNA polymerase， bringing about a “turn-off” monomer fluorescence signal. Therefore， the fluorescence changes of the probe could be used to directly evaluate the SSBR capability. After feasibility verification and a series of conditions optimization， the assessment of SSBR capacity by nucleoprotein extracted from different cells was investigated and the results showed that， compared to the primary cell， the tumor cell lines do not have the ability of SSBR. We also explored the deficiency of tumor cells SSBR by compensation with extra SSBR key enzymes and the results indicated that something might inhibit the SSBR in tumor cell lines. Furthermore， the reporter system could detect SSBR of 500 cells and was successfully applied to anti-aging drug screening. The advantages of this method include simple procedure， less time， and good repeatability， and this method can be used for the rapid detection of SSBR capacity of different cells.

Key words: Single-strand break repair, Pyrene excimer, Hairpin oligonucleotide probe, Primary cell, Tumor cell

中图分类号:

O657.39

TrendMD:

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图/表 6

Fig.1 Practicability analysis of the pyrene excimer⁃based oligonucleotide probe system（A） Fluorescence spectra change between repair and unrepair sensing system in the presence or absence of γ-CD. Repair： a. Oligo mix+T4 PNK+T4 DNA ligase+Bst DNA polymerase+γ-CD， b. Oligo mix+T4 PNK+T4 DNA ligase+Bst DNA polymerase； Unrepair： c. Oligo mix+Bst DNA polymerase+γ-CD， d. Oligo mix+Bst DNA polymerase. Inset： fluorescence photos of repair system（left） and unrepair system（right）. （B） DNA-PAGE analysis of the different products. a. Oligo B； b. Oligo full⁃length（Oligo A+Oligo B without pyrene）； c. Oligo mix； d. repair； Oligo mix+T4 PNK+T4 DNA ligase+Bst DNA polymerase； e. unrepair， Oligo mix+Bst DNA polymerase.

Fig.2 Condition optimization of the pyrene excimer⁃based fluorescence system（A） Fluorescence intensity changes of solutions at 488 nm under different Bst DNA polymerase incubating at different times；（B） fluorescence intensity as a function of the reaction time.

Fig.3 Effect of T4 DNA ligase and T4 PNK on the fluorescence variation of the pyrene excimer⁃based detection system（A） Fluorescence emission spectra with different concentrations of T4 DNA ligase；（B） fluorescence intensity changes of solutions at 488 nm under different concentrations of T4 DNA ligase， T4 PNK concentration was fixed at 200 U/mL；（C） fluorescence emission spectra with different T4 PNK concentrations；（D） the relationship between fluorescence ratio at 488 nm and T4 PNK concentration. Ligase concentration was fixed at 1.6 U/μL.

Fig.4 Study on the difference in SSBR ability between different cells（A） Optimization of mouse fetal fibroblast nuclear protein complex；（B） fluorescence intensity of pyrene excimer in different cells’ nucleoprotein complexes. a. Fetal fibroblasts， b. HepG2， c. 296T， d. Hela， e. PK-15； f. A549；（C） fluorescence intensity of the Hela and fetal fibroblast detection system with extra ligase or T4 PNK； the amount of T4 DNA ligase and T4 PNK is 1600 U/mL and 200 U/mL， respectively；（D） fluorescence intensity of pyrene excimer in different primary cells.

Fig.5 Detection limit of the excimer⁃based hairpin probe（A） Fluorescence emission spectrum with different numbers of cells；（B） fluorescence intensity of pyrene excimer at 488 nm with different numbers of cells.

Fig.6 Detection of potential anti⁃aging drugs（A） Cell viability test by CCK-8；（B） fluorescence intensity of the detection system treated with anti-aging drugs. The concentration of NMN， spermidine and Vitamine C is 100 μmol/L， 20 μmol/L， and 100 μmol/L， respectively.

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