标志物研究中常用蛋白组学质谱方法的定量准确性评估

doi:10.7503/cjcu20240311

摘要/Abstract

摘要：

在疾病发生过程中, 蛋白质的表达水平、修饰状态或相互作用模式的变化有可能反映病理状态或疾病进展, 因此蛋白质常被用作疾病标志物. 基于质谱的蛋白质组学发现了大量的潜在疾病标志物, 这些标志物及其质谱检测方法能否进一步推广至临床检测, 定量准确性和稳定性是关键. 本文合成了32条标准肽段, 对数据非依赖性采集(DIA)、多反应监测(MRM)及平行反应监测(PRM) 3种有潜力在临床质谱方面大规模应用的定量方法进行了比较和评估. 将肽段稀释成4个不同的浓度来模拟不同丰度的实际样本, 用以上3种质谱方法采集数据后, 比较了肽段发现率、标准曲线线性、日间和日内精密度及保留时间(RT)漂移等情况, 总结了3种定量方法各自的优缺点和潜在应用方向. 结果表明, MRM定量方法最适合临床应用, 在于其优异的日间日内稳定性、灵敏度和定量精度； PRM适合科研方向靶向定量, 因其拥有最高灵敏度和较高稳定性定量精度；而DIA由于高通量而依赖于软件和算法解析, 定量数目多的同时, 对于特定肽段定量准确性比PRM/MRM差.

关键词: 临床质谱, 蛋白质组学, 平行反应监测, 多反应监测, 数据非依赖性采集

Abstract:

In the progression of diseases， changes in protein expression levels， modification states， or interaction patterns may reflect pathological conditions or disease advancement， making proteins commonly used as disease biomarkers. Mass spectrometry-based proteomics has identified numerous potential disease biomarkers. However， these biomarkers and their mass spectrometry detection methods need to have high quantitative accuracy and stability for further clinical application. This study synthesized 32 standard peptides and evaluated three quantitative methods data independent acquisition（DIA）， multiple reaction monitoring（MRM）， and parallel reaction monitoring（PRM）， for their potential in large-scale clinical applications in mass spectrometry. We simulated actual samples at four different concentrations to assess peptide discovery rates， standard curve linearity， inter-day and intra-day precision， and retention time shift using the aforementioned three mass spectrometry methods. The results indicate that MRM quantification is most suitable for clinical applications due to its good stability， sensitivity， and quantitative accuracy. PRM is suitable for targeted quantification in research settings， which can offer high sensitivity and stability. Finally， despite its high throughput nature， DIA demonstrates inferior quantitative accuracy for specific peptides compared to PRM and MRM.

Key words: Clinical mass spectrometry, Proteomics, Parallel reaction monitoring, Multiple reaction monitoring, Data independent acquisition

中图分类号:

O657

TrendMD:

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图/表 6

Table 1 Detail of the 32 peptide sequence

No.	Peptide sequence	No.	Peptide sequence
1	VSVHVIEGDHR	17	YLENYDAIR
2	AVTEQGHELSNEER	18	EANLLNAVIVQR
3	LVGSQEELASWGHEYVR	19	TEHINIHQLR
4	AQLFALTGVQPAR	20	AIGSASEGAQSSLQEVYHK
5	IQALQQQADEAEDR	21	TAFQEALDAAGDK
6	LVLVGDGGTGK	22	VYALPEDLVEVNPK
7	EAAENSLVAYK	23	NIETIINTFHQYSVK
8	SVTEQGAELSNEER	24	SGGASHSELIHNLR
9	FASENDLPEWK	25	SAGPQSQLLASVIAEK
10	LQDAEIAR	26	YFHVVIAGPQDSPFEGGTFK
11	LALQAQPVPDELVTK	27	TEGDGVYTLNNEK
12	FSGWYDADLSPAGHEEAK	28	VILENIASHEPR
13	IIFEDDR	29	ESSSHHPGIAEFPSR
14	AIVQLVNER	30	LVNEVTEFAK
15	VSEEIEDIIK	31	EQLTPLIK
16	HLFTGPVLSK	32	VGAHAGEYGAEALER

Fig.1 Evaluation of three quantitative methods using 32 standard peptides at four concentrationsEach method includes the creation of a standard curve， intraday technical repetition， and daytime repetition. Data analysis is performed using Skyline for MRM and PRM， and Spectronaut for DIA， to evaluate the performance and reliability of these quantitative methods.

Fig.2 Detection and quantification of peptide EANLLNAVIVQR at 8 fmol/μL using DIA(A), MRM(B), and PRM(C) methodsDifferent colors represent different MS2 fragments.

Fig.3 Coefficient of variation(CV) analysis for peptide quantification methods（A） Using DIA across four concentrations；（B） using MRM and PRM；（C） comparison of CV for the retention time（RT） between MRM and PRM across four replicates.

Fig.4 Quantitative performance using DIA, PRM, and MRM methods on peptide TEHINIHQLR（A—C） Standard curves using DIA， PRM， and MRM respectively；（D） comparison of R2 in the quantification of the 32 peptides across MRM， PRM， and DIA methods， indicating the linearity of the quantification for each method；（E） detailed comparison of R2 for MRM and PRM methods， showing high reproducibility and accuracy in the quantification.

Fig.5 Daytime RT shift and CV of peak areas for PRM(A) and MRM(B) methods of VSVHVIEGDHR and CVs of peak areas between MRM and PRM methods across different days(C)

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