催化RNA切割反应的苏糖核酸酶的表征及在切割microRNA中的应用

doi:10.7503/cjcu20220246

摘要/Abstract

摘要：

对一条催化RNA切割反应的苏糖核酸(TNA)酶6-29进行了系统的生物化学表征，探究了TNA酶6-29对RNA底物的序列要求，测定了TNA酶6-29催化反应的酶学常数，并进一步开发了TNA酶6-29在切割 microRNA中的应用. 研究结果表明， TNA酶6-29能够耐受底物结合臂和切割位点的多种变化，具有良好的底物序列通用性; TNA酶6-29能够在镁离子和锰离子等多种金属离子的存在下发挥催化活性，并且能够催化多个底物分子发生切割反应，具有酶的典型特征. 基于TNA酶6-29良好的普适性，进一步展示了TNA酶6-29可以切割不同序列microRNA分子. 本文结果表明，具有催化活性的TNA是一种有潜力的分子工具，有望进一步应用于疾病诊疗领域.

关键词: 核酸化学, 非天然核酸, 苏糖核酸, 核酶, 功能核酸

Abstract:

In this work， we systematically characterized a previously identified RNA-cleaving threose nucleic acid（TNA） enzyme 6-29 including the substrate sequence requirement and reaction rate constant， and further demonstrated its application in microRNA cleavage. It was revealed that 6-29 possessed a relatively broad substrate sequence scope and was able to cleave RNAs with distinct sequences and cleavage sites. Moreover， TNA enzyme 6-29 remained active in the presence of a variety of metal ions such as Mg²⁺ and Mn²⁺， and functioned under a multi-turnover condition. Lastly， it was demonstrated that 6-29 catalysed site-specific cleavage reactions on severaldifferent microRNA sequences. This work highlights catalytic TNA as a promising molecular tool， which could be developed to act as a key functional element in disease theranostics.

Key words: Nucleic acid chemistry, Xenobiological nucleic acid, Threose nucleic acid, Ribozyme, Functional nucleic acid

中图分类号:

TrendMD:

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图/表 5

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Oligo name	Sequence（5'⁃3'）
Primer P1	GACACTCGTATGCAGTACG
6⁃29 Template	Biotin⁃AACTCATCCCCTTATTGAGAGCTCGACGTACTGCATACGAGTGTC
Substrate 1（S1）	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGCAGCUCGA）
Transition template	Biotin⁃GGTCTGCTCCCTTATTGAGAATCTAGCGTACTGCATACGAGTGTC
Transition substrate	Cy5⁃r（GGUCUGCUAUGCAAUCUAG）
Transversion 1 template	Biotin⁃TTGAGTAGCCCTTATTGAGACGAGCTCGTACTGCATACGAGTGTC
Transversion 1 substrate	Cy5⁃r（UUGAGUAGAUGCACGAGCU）
Transversion 2 template	Biotin⁃CCAGACGACCCTTATTGAGATAGATCCGTACTGCATACGAGTGTC
Transversion 2 substrate	Cy5⁃r（CCAGACGAAUGCAUAGAUC）
Substrate AA	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGAAGCUCGA）
Substrate AU	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGAUGCUCGA）
Substrate AC	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGACGCUCGA）
Substrate AG	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGAGGCUCGA）
Substrate UA	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGUAGCUCGA）
Substrate UU	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGUUGCUCGA）
Substrate UC	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGUCGCUCGA）
Substrate UG	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGUGGCUCGA）
Substrate CU	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGCUGCUCGA）
Substrate CC	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGCCGCUCGA）
Substrate CG	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGCGGCUCGA）
Substrate GA	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGGAGCUCGA）
Substrate GU	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGGUGCUCGA）
Substrate GC	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGGCGCUCGA）
Substrate GG	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGGGGCUCGA）
miR⁃188⁃3p RNA	Cy5⁃r（CUCCCACAUGCAGGGUUUGCA）
miR⁃19a⁃3p RNA	Cy5⁃r（UGUGCAAAUCUAUGCAAAACUGA）
miR⁃233⁃3p RNA	Cy5⁃r（UUGAGCAAUGCGCAUGUGCGGGA）
188⁃3p template	Biotin⁃CTCCCACCCCTTATTGAGAGGGTTTGCACGTACTGCATACGAGTGTC
19a⁃3p template	Biotin⁃TGTGCAAATCTCCCTTATTGAGAAAACTGACGTACTGCATACGAGTGTC
233⁃3p template	Biotin⁃TTGAGCACCCTTATTGAGACATGTGCGGGACGTACTGCATACGAGTGTC
188⁃3p DNAzyme 8⁃17	TGCAAACCCTTCCAGCGGATCGAACATGTGGGAG
19a⁃3p DNAzyme 8⁃17	TCAGTTTTTCCAGCGGATCGAACATAGATTTGCACA
233⁃3p DNAzyme 8⁃17	TCCCGCACATGTTCCAGCGGATCGAACATTGCTCAA

Oligo name	Sequence（5'⁃3'）
Primer P1	GACACTCGTATGCAGTACG
6⁃29 Template	Biotin⁃AACTCATCCCCTTATTGAGAGCTCGACGTACTGCATACGAGTGTC
Substrate 1（S1）	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGCAGCUCGA）
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Transition substrate	Cy5⁃r（GGUCUGCUAUGCAAUCUAG）
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Transversion 1 substrate	Cy5⁃r（UUGAGUAGAUGCACGAGCU）
Transversion 2 template	Biotin⁃CCAGACGACCCTTATTGAGATAGATCCGTACTGCATACGAGTGTC
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Substrate CC	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGCCGCUCGA）
Substrate CG	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGCGGCUCGA）
Substrate GA	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGGAGCUCGA）
Substrate GU	Cy5⁃r（AACUCAUCAUGGUGCUCGA）
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