基于ThT荧光寿命检测蛋清溶菌酶蛋白寡聚体

doi:10.7503/cjcu20180397

高等学校化学学报 ›› 2019, Vol. 40 ›› Issue (1): 90.doi: 10.7503/cjcu20180397

基于ThT荧光寿命检测蛋清溶菌酶蛋白寡聚体

李成¹, 宋吉雪¹, 刘婷婷¹, 李妍¹, 刘冰南¹, 王亮¹, 肖珊¹, 李琳², 耿旭辉³(), 王际辉^1,²()

1. 大连工业大学生物工程学院, 大连 116034
2. 东莞理工学院化学工程与能源技术学院, 东莞 523808
3. 中国科学院分离分析化学重点实验室, 大连 116023

收稿日期:2018-05-30 出版日期:2019-01-10 发布日期:2018-12-12
作者简介:
联系人简介: 王际辉, 男, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事天然活性物质的开发及活性方面的研究.E-mail: wangjh_dlpu@163.com;耿旭辉, 男, 博士, 副研究员, 主要从事高灵敏光学传感器方面的研究. E-mail: xuhuigeng@126.com
基金资助:
国家重点研发计划项目(批准号: 2016YFD0400203)、辽宁省自然科学基金重点项目(批准号: 20170520043)和中国科学院分离分析化学重点实验室开放基金(批准号: KL-1704)资助.

Detection of Egg White Lysozyme Oligomers Based on Fluorescence Lifetime of ThT^†

LI Cheng¹, SONG Jixue¹, LIU Tingting¹, LI Yan¹, LIU Bingnan¹, WANG Liang¹, XIAO Shan¹, LI Lin², GENG Xuhui^3,^*(), WANG Jihui^1,^2,^*()

1. School of Biological Engineering, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China
2. School of Chemical Engineering & Energy Technology, Dongguan University of Technology, Dongguan 523808, China;
3. CAS Key Laboratory of Separation Science for Analytical Chemistry, Dalian 116032, China

Received:2018-05-30 Online:2019-01-10 Published:2018-12-12
Contact: GENG Xuhui,WANG Jihui E-mail:xuhuigeng@126.com;wangjh_dlpu@163.com
Supported by:
† Supported by the National Key Research Program of China(No.2016YFD0400203), the Natural Science Foundation of Liaoning Province, China(No.20170520043) and the Open Laboratory Fund of Key Laboratory of Separation and Analytical Chemistry, Chinese Academy of Sciences, China(No.KL-1704).

摘要/Abstract

摘要：

采用时间分辨荧光技术, 检测了不同形态蛋白聚集体的荧光染料硫磺素T(ThT)荧光寿命. 利用蛋清溶菌酶体外制备了蛋白聚集体; 采用透射电子显微镜(TEM)及ThT稳态荧光检测了结合蛋白纤维生长的动力学曲线, 确定其形成寡聚体及纤维样聚集体的特征和时间. 通过时间相关单光子计数(TCSPC)技术测定了蛋清溶菌酶单体、寡聚体和淀粉样纤维的ThT荧光寿命曲线, 并拟合、计算其荧光寿命. 根据圆二色谱(CD)分析结果推测聚集体的结构不同导致其与ThT的结合状态不同, 从而影响ThT荧光寿命. 结果表明, 通过测定ThT荧光寿命可以区分蛋白单体、寡聚体和纤维样聚集体, 并监测蛋白寡聚体的形成, 为后续病理蛋白聚集过程中形成寡聚体物质的监测提供了研究基础.

关键词: 寡聚体, 硫磺素T, 时间相关单光子计数, 荧光寿命

Abstract:

Thioflavin T(ThT) fluorescence lifetime was used to detect aggregates states by time-resolved fluorescence. The protein aggregation was made by the egg white lysozyme in vitro. The characteristics of the oligomer and fibril were determined by means of transmission electron microscopy, ThT steady-state fluorescence and the growth kinetic curve of aggregation. The time-correlated single-photon counting technique was used to measure the fluorescence lifetime of ThT incubation with the aggregations. It calculated the fluorescence lifetime by fitting to the double exponential equation. The results of circular dichroism speculated that the structure of different aggregates was different and affected the fluorescence lifetime of ThT. It demonstrated that ThT fluorescence lifetime can distinguish protein monomers, oligomers and fibrils, and monitor the formation of protein oligomers. The results provide a basis for the monitoring of oligomer substances in the proess of sub-sequent pathological protein aggregation.

Key words: Oligomer, Thioflavin T, Time dependent single photon counting, Fluorescence lifetime

中图分类号:

O629.73

TrendMD:

李成, 宋吉雪, 刘婷婷, 李妍, 刘冰南, 王亮, 肖珊, 李琳, 耿旭辉, 王际辉. 基于ThT荧光寿命检测蛋清溶菌酶蛋白寡聚体. 高等学校化学学报, 2019, 40(1): 90.

LI Cheng,SONG Jixue,LIU Tingting,LI Yan,LIU Bingnan,WANG Liang,XIAO Shan,LI Lin,GENG Xuhui,WANG Jihui. Detection of Egg White Lysozyme Oligomers Based on Fluorescence Lifetime of ThT^†. Chem. J. Chinese Universities, 2019, 40(1): 90.

图/表 6

Fig.1 TEM images of egg lysozyme aggregations at different incubation time(A) The egg lysozyme without any treatment; (B—I) the aggregation samples for egg lysozyme at different time points(1, 2, 4, 6, 9, 12, 16 and 20 d), respectively.

Fig.2 Chemical structure of thioflavin-T Arrows showing rotational movement around the central carbon bond.

Fig.3 Steady state fluorescence emission(A) and the kinetic curve of aggregation(B) for the hen lysozyme samples in the experimental condition

Fig.4 Fluorescence emission decay curves of ThT incubation with the samples of the egg lysozyme Incubation time/d: a. 0; b. 2; c. 16.

Table 1 Kinetic analysis of emission decay for ThT in the presence of egg lysozyme aggregation samples for different incubation time*

Sample	t/d	a₁	τ₁/ns	a₂	τ₂/ns	<τ>/ns
Monomer	0	6553.79	0.22	2060.40	0.76	0.50
Oligomer	1	1405.85	0.41	8060.29	1.13	1.09
	2	5130.40	0.99	5134.20	1.13	1.06
Fibril	4	7893.80	0.96	1699.00	2.62	1.57
	8	7656.82	0.92	2111.02	2.42	1.55
	12	7864.63	1.02	1735.95	2.73	1.66
	16	8323.95	1.00	1289.17	2.88	1.58

Fig.5 CD spectra of the egg lysozyme aggregationIncubation time/d: a. 0; b. 2; c. 16.

参考文献 22

[1]	Landreh M., Sawaya M., Hipp M., Eisenberg D., Wüthrich K., Hartl F., Intern. Med., 2016, 280, 164—176
[2]	Pinney J. H., Hawkins P. N., Ann. Clin. Biochem.,2012, 49(3), 229—241
[3]	Stefani M., FEBS J., 2010, 277(22), 4602—4613
[4]	Song S. M., Ma X. W., Zhou Y. H., Xu M. T., Shuang S. M., Dong C., Chem. Res. Chinese Universities,2016, 32(2), 172—177
[5]	Gharibyan A. L., Zamotin V., Yanamandra K., Moskaleva O. S., Margulis B. A., Kostanyan I. A., Morozova-Roche L. A., Mol. Biol. J., 2007, 365, 1337—1349
[6]	Sarroukh R., Goormaghtigh E., Ruysschaert J. M., Raussens V., Biochim. Biophys. Acta,2013, 1828, 2328—2338
[7]	Biancalana M., Makabe K., Koide A., Molecular S., Journal of Molecular Biology,2009, 385(4), 1052—1063
[8]	Verma M., Vats A., Taneja V., Annals of the Indian Academy of Neurology,2015, 18, 138—145
[9]	Akihito H., Hiroyuki A., Akio K., Biosci. Biotechol. Biochem., 2008, 72(6), 1523—1530
[10]	Frare E., Mossuto M. F., de Laureto P. P., Tolin S., Menzer L., Dumoulin M., Dobson C. M., Fontana A., Mol. Biol. J., 2009, 387, 17—27
[11]	Orte A., Birkett N. R., Clarke R. W., Devlin G. L., Dobson C. M., Klenerman D., Proc. Natl. Acad Sci. USA,2008, 105, 14424—14429
[12]	Landau M., Sawaya M. R., Faull K. F., Laganowsky A., Jiang L., Sievers S. A., Liu J., Barrio J. R., Eisenberg D., PLoS Biol.,2011, 9(6), e1001080
[13]	Song S., Wang Y., Xiong L., Qu L., Xu M., Chem. Res. Chinese Universities,2013, 29(1), 20—25
[14]	David J. L., Moa S. W., Melina G. G., Fredrik W., Elin K. E., Biochem. Biophys. Res. Commun., 2015, 458, 418—423
[15]	Hanczyc P., Sznitko L., Zhong C., Heeger A., ACS Photonics. J.,2015, 2, 1755—1762
[16]	Dumoulin M., Kumita J. R., Dobson C. M., Acc. Chem. Res.,2006, 39, 603—610
[17]	Biancalana M., Koide S., Biochim. Biophys. Acta,2010, 1804, 1405—1412
[18]	Amdursky N., Erez Y., Huppert D., Acc. Chem. Res.,2012, 45(9), 1548—1557
[19]	Singh P. K., Mora A. K., Nath S., Chem. Commun.,2015, 51, 14042—14045
[20]	Xue W. F., Hellewell A. L., Gosal W. S., Biol. Chem. J.,2009, 284, 34272—34282
[21]	Chen Y. C., Pu Y. C., Hsu Y. J., J. Phys. Chem. C,2012, 116, 2967—2975
[22]	Sznitko L., Hanczyc P., Mysliwiec J., Samoc M., Appl. Phys. Lett.,2015, 106, 023702

基于ThT荧光寿命检测蛋清溶菌酶蛋白寡聚体

Detection of Egg White Lysozyme Oligomers Based on Fluorescence Lifetime of ThT^†

RichHTML

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 6

参考文献 22

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

[1]	孙佳音, 卢可, 刘广志, 刘璐, 潘文蓉, 张思静, 秦伟, 吴根华. 两个基于氢键构筑的超分子镁配合物的合成、晶体结构及荧光性质[J]. 高等学校化学学报, 2017, 38(5): 729.
[2]	黄尖, 刘志刚, 范瑞清, 董玉伟, 张会杰, 王雨雷, 杨玉林. 新型氯桥连一维链结构Cd(Ⅱ)配位聚合物的合成、结构及蓝光性能[J]. 高等学校化学学报, 2015, 36(3): 411.
[3]	汤胤旻, 霍延平, 胡升, 张焜, 赵丰华, 欧阳新华. 新型含噻吩基8-羟基喹啉锌配合物的合成及光电性能[J]. 高等学校化学学报, 2014, 35(1): 48.
[4]	孙颖任爱民李作盛闵春刚任雪峰封继康. 海萤荧光素类似物发光反应机理的理论研究[J]. 高等学校化学学报, 2011, 32(11): 2586.
[5]	钱鹰, 朱晓勤, 吉彦, 黄维, 吕昌贵, 崔一平. 2,4和8-支噁二唑衍生物的三光子吸收和三光子上转换荧光[J]. 高等学校化学学报, 2010, 31(4): 703.
[6]	王燕萍, 张恺, 魏浩桐, 孟庆男, 周鼎, 姜力铭, 杨柏. CdTe@TiO2复合纳米微粒的制备与表征[J]. 高等学校化学学报, 2010, 31(11): 2153.
[7]	安利民, 曾庆辉, 赵家龙, 宋维斯, 苏文辉. CdTe/CdS量子点的Ⅰ-Ⅱ型结构转变与荧光性质[J]. 高等学校化学学报, 2009, 30(9): 1789.
[8]	黄珊, 肖琦, 何治柯, 刘义. CdSe量子点探针共振光散射法检测溶菌酶[J]. 高等学校化学学报, 2009, 30(10): 1951.
[9]	柏正武, 俞开潮, 卓仁禧. 两亲性寡聚体Gd(Ⅲ)配合物的合成及肝选择性磁共振造影[J]. 高等学校化学学报, 2004, 25(8): 1582.
[10]	高义德, 陈旸, 裴林森, 马华强, 马兴孝, 陈从香. CCl₂(A¹B₁)被甲烷及氯代甲烷猝灭动力学[J]. 高等学校化学学报, 2001, 22(6): 1006.
[11]	孙照勇, 艾希成, 冯娟, 张启元, 张兴康. 铕(Ⅲ)荧光增敏体系在微乳液中的发光性质和荧光衰减动力学研究[J]. 高等学校化学学报, 2001, 22(11): 1856.
[12]	姚光庆, 张亮, 苏勉曾. Eu²⁺和Mn²⁺在Sr₃MgSi₂O₈中的光致发光研究[J]. 高等学校化学学报, 1997, 18(1): 1.
[13]	姚光庆, 张亮, 苏勉曾. Eu²⁺和Mn²⁺在SrMgP₂O₇中的光致发光及其能量传递[J]. 高等学校化学学报, 1995, 16(8): 1161.
[14]	周德建, 甘良兵, 谭海松, 骆初平, 姚光庆, 黄春辉. 两种C₆₀-甘氨酸酯衍生物的室温荧光光谱[J]. 高等学校化学学报, 1995, 16(10): 1512.
[15]	赵伟, 陈晓波, 宋增福, 苏勉曾. 固溶体BaFCl_1-xBr_x:Eu²⁺中不同发光中心及其时间分辨特性[J]. 高等学校化学学报, 1993, 14(12): 1633.

基于ThT荧光寿命检测蛋清溶菌酶蛋白寡聚体

Detection of Egg White Lysozyme Oligomers Based on Fluorescence Lifetime of ThT†

RichHTML

PDF (PC)

可视化

摘要/Abstract

引用本文

使用本文

图/表 6

参考文献 22

相关文章 15

编辑推荐

Metrics

本文评价

Detection of Egg White Lysozyme Oligomers Based on Fluorescence Lifetime of ThT^†