Analysis of Glycosylation Modification of Human Erythropoietin Expressed in Pernyi Pupae

doi:10.7503/cjcu20240479

Abstract

Abstract:

Recombinant human erythropoietin（rhEPO） was expressed in pernyi pupae using DNA recombination technology and gel purified. The purified components were separated by SDS-PAGE（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis）， and the rhEPO gel strips were cut and its glycosylation modification was detected by electrospray ionization tandem mass spectrometry（ESI-MS/MS）. The mass spectrometry results showed that the glycosylation modification sites of rhEPO expressed in pernyi silkworm pupae were consistent with EPO expressed in humans， with three N-glycosylation sites and one O-glycosy-lation site. Although the specific sugar chains at the glycosylation sites cannot be determined based on ESI-MS/MS， its results combined with lectin experiments can help determine the specific sugar chains at the glycosylation modification sites. According to the results， the overall sugar chain lacks sialic acid modification. The results of cell experiments showed that rhEPO expressed by pernyi pupae had certain biological activity， with a specific activity of 1190 U/μg. Therefore， pernyi pupae can express rhEPO without sialic acid modification with certain biological activity， and low sialylated EPO can play an important role in the treatment of central nervous system diseases after nasal administration. The results provide a basis for further studying the glycosylation and biological activity of exogenous proteins after expression in the pernyi pupae-Anthraea pernyi nucleopolyhedrorirus（ApNPV） host vector expression system.

Key words: Electrospray ionization mass spectrometry（ESI-MS/MS）, Erythropoietin, Pernyi pupae, Glycosylation

CLC Number:

TrendMD:

LIU Xiaoli, LIU Yubo, LI Xuechen, CHEN Qiushi, FAN Qi, ZHANG Jianing, LI Wenli. Analysis of Glycosylation Modification of Human Erythropoietin Expressed in Pernyi Pupae[J]. Chem. J. Chinese Universities, 2025, 46(4): 20240479.

Figures/Tables 8

References 29

1	Wenger R. H.， Kurtz A.， Compr. Physiol.， 2011， 1（4）， 1759—1794
2	Sasaki R.， Masuda S.， Nagao M.， Biosci. Biotechnol. Biochem.， 2000， 64（9）， 1775—1793
3	Banks D. D.， J. Mol. Biol.， 2011， 412（3）， 536—550
4	Schütz A.， Bernhard F.， Berrow N.， Buyel J. F.， Ferreira⁃da⁃Silva F.， Haustraete J.， van den Heuvel J.， Hoffmann J. E.， de Marco A.， Peleg Y.， Suppmann S.， Unger T.， Vanhoucke M.， Witt S.， Remans K.， STAR Protoc.， 2023， 4（4）， 102572
5	Zhang C. L.， Zhu X.， Li J. L.， Chinese J. Biol.， 2004， 17（2）， 123—125
	张春莉，朱迅，李景利. 中国生物制品学杂志， 2004， 17（2）， 123—125
6	Zhang S. J.， Luo Y. M.， Wang R. L.， J. Integr. Neurosci.， 2020， 19（3）， 561—570
7	Castillo C.， Zaror S.， Gonzalez M.， Hidalgo A.， Burgos C. F.， Cabezas O. I.， Hugues F.， Jiménez S. P.， González⁃Horta E.， González⁃Chavarría I.， Gavilán J.， Montesino R.， Sánchez O.， Lopez M. G.， Fuentealba J.， Toledo J. R.， Redox Biol.， 2018， 14， 285—294
8	Rama R.， Garzón F.， Rodríguez⁃Cruz Y.， Maurice T.， García⁃Rodríguez J. C.， Neural Regen. Res.， 2019， 14（9）， 1519—1521
9	García⁃Artalejo J. A.， Mancera⁃Arteu M.， Sanz⁃Nebot V.， Rodríguez T.， Giménez E.， J. Pharm. Biomed. Anal.， 2022， 213， 114686
10	Pedroso I.， Garcia M.， Casabona E.， Morales L.， Bringas M. L.， Pérez L.， Rodríguez T.， Sosa I.， Ricardo Y.， Padrón A.， Amaro D.， Behav. Sci. （Basel）， 2018， 8（5）， 150—158
11	Ehrenreich H.， Hinze⁃Selch D.， Stawicki S.， Aust C.， Knolle⁃Veentjer S.， Wilms S.， Heinz G.， Erdag S.， Jahn H.， Degner D.， Ritzen M.， Mohr A.， Wagner M.， Schneider U.， Bohn M.， Huber M.， Czernik A.， Pollmächer T.， Maier W.， Sirén A. L.， Klosterkötter J.， Falkai P.， Rüther E.， Aldenhoff J. B.， Krampe H.， Mol. Psychiatry， 2007， 12（2）， 206—220
12	Barbieri M.， Chiodini P.， Di Gennaro P.， Hafez G.， Liabeuf S.， Malyszko J.， Mani L. Y.， Mattace⁃Raso F.， Pepin M.， Perico N.， Simeoni M.， Zoccali C.， Tortorella G.， Capuano A.， Remuzzi G.， Capasso G.， Paolisso G.， Pharmacol. Res.， 2024， 203， 107146
13	Macias⁃Velez R. D.， Rivera⁃Cervantes M. C.， Marín⁃López A. G.， Murguía⁃Castillo J.， Neurosci. Lett.， 2023， 812， 137366
14	Nagai R.， Ebihara T.， Kakino K.， Masuda A.， Xu J.， Minamihata K.， Kamiya N.， Kongkrongtong T.， Kawahara M.， Mon H.， Fujii T.， Kusakabe T.， Lee J. M.， J. Asia⁃Pac. Entomol.， 2021， 24（3）， 544—549
15	Zhang Y. C.， Chinese J. Biol.， 2020， 33（12）， 14544—1459
	张逸驰. 中国生物制品学杂志， 2020， 33（12）， 14544—1459
16	Chen J.， Fang H. Q.， Zhou C. L.， Chen H. P.， China Biotechnol.， 2004， 24（3）， 1—6
	陈璟，方宏清，周长林，陈惠鹏. 中国生物工程杂志， 2004， 24（3）， 1—6
17	Ghosh S.， Sialic Acid and Biology of Life： An Introduction. Sialic Acids and Sialoglycoconjugates in the Biology of Life， Health and Disease.， Academic Press.， Switzerland， 2020， 1—61
18	Wang X. Y.， Shi S. L.， Li Q.， J. Shenyang Agr. U.， 2007， 38（3）， 259—264
	王学英，石生林，李群. 沈阳农业大学学报， 2007， 38（3）， 259—264
19	Demir R.， Şahar U.， Deveci R.， BBA⁃Proteins Proteom.， 2021， 1869（2）， 140559
20	Gu S. Y.， Synthesis of Polyethylenimine Derivatives and Function in Gene Delivery， Dalian University of Technology， Panjin， 2020
	古苏云. 聚乙烯亚胺衍生物的合成及在基因递送中的作用研究，盘锦：大连理工大学， 2020
21	Karki U.， Wright T.， Xu J. F.， J. Biotechnol.， 2022， 355， 10—20
22	Demir R.， Şahar U.， Deveci R.， Biol. Bull.， 2022， 242（2）， 118—126
23	Sparbier K.， Wenzel T.， Kostrzewa M.， J. Chromatogr. B， 2006， 840（1）， 29—36
24	Bojar D.， Meche L.， Meng G. M.， Eng W.， Smith D. F.， Cummings R. D.， Mahal L. K.， ACS Chem. Biol.， 2022， 17（11）， 2993—3012
25	Fard M. G.， Khabir Z.， Reineck P.， Cordina N. M.， Abe H.， Ohshima T.， Dalal S.， Gibson B. C.， Packer N. H.， Parker L. M.， Nanoscale Adv.， 2022， 4（6）， 1551—1564
26	Chen Q. S.， Liu H， Li X. C.， Explor. Drug Sci.， 2023， 1， 31—54
27	Liao F. L.， Yang Z. F.， Liu Y.， Wu Y. Z.， Chinese J. New Drugs， 2016， 25（1）， 64—70
	廖飞龙，杨仲璠，刘煜，吴彦卓. 中国新药杂志， 2016， 25（1）， 64—70
28	Takegawa Y.， Ito H.， Keira T.， Deguchi K.， Nakagawa H.， Nishimura S. I.， J. Sep. Sci.， 2008， 31（9）， 1585—1593
29	Gong B.， Burnina I.， Stadheim T. A.， Li H. J.， J. Mass Spectrom.， 2013， 48（12）， 1308—1317

N⁃glycosylation sites	N⁃glycan component
Asn48	HexNAc2Hex2	HexNAc2Hex2Fuc	HexNAc2Hex3	HexNAc2Hex3Fuc
Asn62	HexNAcFuc	HexNAc2HexFuc	HexNAc2Hex2Fuc	HexNAc2Hex3Fuc
Asn62	HexNAc2Hex	HexNAc2Hex2	HexNAc2Hex3
Asn107	HexNAcFuc	HexNAc2Hex2Fuc2	HexNAc2Hex5Fuc	HexNAc3Hex4
	HexNAc2Hex	HexNAc2Hex3	HexNAc2Hex6	HexNAc3Hex4Fuc
	HexNAc2HexFuc	HexNAc2Hex3Fuc	HexNAc2Hex7	HexNAc3Hex5Fuc2
	HexNAc2HexFuc2	HexNAc2Hex3Fuc2	HexNAc3Hex3	HexNAc4Hex3Fuc
	HexNAc2Hex2	HexNAc2Fuc	HexNAc3Hex3Fuc	HexNAc2Hex2Fuc
	HexNAc2Hex4Fuc	HexNAc3Hex3Fuc2	HexNAc2Hex4	HexNAc2Hex5

N⁃glycosylation sites	N⁃glycan component
Asn48	HexNAc2Hex2	HexNAc2Hex2Fuc	HexNAc2Hex3	HexNAc2Hex3Fuc
Asn62	HexNAcFuc	HexNAc2HexFuc	HexNAc2Hex2Fuc	HexNAc2Hex3Fuc
Asn62	HexNAc2Hex	HexNAc2Hex2	HexNAc2Hex3
Asn107	HexNAcFuc	HexNAc2Hex2Fuc2	HexNAc2Hex5Fuc	HexNAc3Hex4
	HexNAc2Hex	HexNAc2Hex3	HexNAc2Hex6	HexNAc3Hex4Fuc
	HexNAc2HexFuc	HexNAc2Hex3Fuc	HexNAc2Hex7	HexNAc3Hex5Fuc2
	HexNAc2HexFuc2	HexNAc2Hex3Fuc2	HexNAc3Hex3	HexNAc4Hex3Fuc
	HexNAc2Hex2	HexNAc2Fuc	HexNAc3Hex3Fuc	HexNAc2Hex2Fuc
	HexNAc2Hex4Fuc	HexNAc3Hex3Fuc2	HexNAc2Hex4	HexNAc2Hex5

[1]	LI Ting, XING Simin, LIU Yang. Visualization of Protein-specific Glycosylation and Photodynamic Therapy via an Enzyme-free Amplification Strategy of Catalytic Hairpin Assembly and Hybridization Chain Reaction [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2023, 44(8): 20230140.
[2]	HU Zhifei, XU Peng, WEI Bingcheng, YU Biao. Total Synthesis of Phenylpropanoid Glycosides,Acteoside, Isoacteoside and Ligupurpuroside J [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2020, 41(8): 1708.
[3]	ZHANG Yanyan, HAO Kaifeng, ZHANG Guoqiang, ZHAO Wei. β-Stereoselectivity of Glucuronic Acid Analogues Mediated by 2-Cyanobenzyl Group ^† [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2019, 40(9): 1904.
[4]	WEI Wanghui,CHU Yanqiu,CHEN Ying,Gao Yanqiu,DING Chuanfan. Quantitative Determination of the Glycosylation Level for the Binding Proteins to High Density Lipoprotein by Mass Spectrometry^† [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2019, 40(6): 1141.
[5]	LI Lingmei, WANG Chengjian, HAN Jianli, LIU Rendan, WEN Yanan, WEI Ming, JIN Wanjun, HUANG Linjuan, WANG Zhongfu. Mass Spectrometric Analysis of N-Glycosylation Sites and N-Glycans of β-Conglycinin^† [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2018, 39(3): 427.
[6]	HAO Su-Juan, WANG Yin-Jue, KANG Ai-Jun, LIU Yong-Dong*, LI Xiu-Nan, SHI Hong, MA Run-Yu, MA Guang-Hui, SU Zhi-Guo. Site-specific PEGylation of Recombinant Human Non-glycosylated Erythropoietin and Characterization of the Mono-PEGylated Conjugate [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2010, 31(11): 2239.
[7]	QI Yan-Feng¹, GAO Xue-Feng¹*, HUANG Xu-Ri². Theoretical Mutation Design of Active Agent of Eryhropoietin and Its Receptor [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2008, 29(3): 615.
[8]	LIU Shu-Qing^1, SUN Ming-Zhong^2, ZHAO Bao-Chang¹. Investigation of Post-translational Modifications of Proteins in the Venom of Chinese Gloydius Shedaoensis Snake by Mass Spectrometry [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2008, 29(11): 2194.
[9]	ZHANG Shou-Qin, ZHANG Jin-Song, WANG Chang-Zheng. Synthesis of Pennogenyl Saponins via Three Methods [J]. Chem. J. Chinese Universities, 2007, 28(3): 462.
[10]	ZHOU Guo-Hua, LUO Guo-An, ZHOU Ke-Yu, GU Zhuo-Liang. On-line Capillary Electrophoresis-mass Spectrometry for Determination of Peptide Mixture and Protein Mixture [J]. Chem. J. Chinese Universities, 1998, 19(3): 353.