核酸等温扩增技术在病毒检测中的应用

doi:10.7503/cjcu20240139

高等学校化学学报 ›› 2024, Vol. 45 ›› Issue (7): 20240139.doi: 10.7503/cjcu20240139

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核酸等温扩增技术在病毒检测中的应用

肖航¹^,², 王小燕¹^,², 邓兆佳¹^,², 廖文静¹^,²^,³, 谢文菁¹^,², 彭汉勇¹^,²()

^1.中国科学院生态环境研究中心, 环境化学与生态毒理学国家重点实验室, 北京 100085
^2.中国科学院大学, 北京 100049
^3.中国科学院大学杭州高等研究院, 环境学院, 杭州 310024

收稿日期:2024-03-25 出版日期:2024-07-10 发布日期:2024-05-15
通讯作者: 彭汉勇 E-mail:hypeng@rcees.ac.cn
作者简介:第一联系人：共同第一作者.
基金资助:
国家自然科学基金(22276199);国家重点研发计划项目(2022YFC3701302);中国科学院先导专项(XDB0750100)

Development of Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies for Virus Detection

XIAO Hang¹^,², WANG Xiaoyan¹^,², DENG Zhaojia¹^,², LIAO Wenjing¹^,²^,³, XIE Wenjing¹^,², PENG Hanyong¹^,²()

^1.State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology，Research Center for Eco?Environmental Sciences，Chinese Academy of Sciences，Beijing 100085，China
^2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China
^3.School of Environment，Hangzhou Institute for Advanced Study，University of Chinese Academy of Sciences，Hangzhou 310013，China

Received:2024-03-25 Online:2024-07-10 Published:2024-05-15
Contact: PENG Hanyong E-mail:hypeng@rcees.ac.cn
Supported by:
the National Natural Science Foundation of China(22276199);the National Key Research and Development Program of China(2022YFC3701302);the Strategic Priority Research Program of the Chinese Academy of Sciences(XDB0750100)

摘要/Abstract

摘要：

病毒是引发人类疾病的主要病原体之一. 传统的聚合酶链式反应（PCR）技术虽然被广泛应用于病毒分子诊断, 但其对温度的要求较为严格, 限制了其在现场诊断中的应用. 为了满足现场快速诊断的需求, 核酸等温扩增技术得到快速发展, 其无需热循环, 可以在恒定温度下实现核酸扩增, 可适应不同的应用场景. 本文综合评述了等温扩增技术在病毒检测领域的最新进展, 从病毒样本采集、核酸提取、等温扩增检测等几个方面分别进行阐述, 探讨了酶辅助等温扩增技术、无酶等温扩增技术以及与多体系串联的级联扩增技术的原理、关键参数及其病毒检测应用, 并对比了市场上相关试剂盒的特点. 此外, 讨论了当前核酸等温扩增技术在病原体检测应用中面临的一些难题, 如提取效率、稳定性和成本等, 提出了未来的发展方向, 为进一步改善现场诊断效率提供了新的思路.

关键词: 等温扩增技术, CRISPR检测, 核酸扩增, 环境病毒, 病毒提取

Abstract:

Viruses play a significant role in causing human diseases， and traditional PCR techniques have been widely used for their molecular diagnosis. However， the temperature requirements of PCR limit its application in field diagnostics. To address the need for rapid on-site diagnosis， isothermal nucleic acid amplification technologies have emerged as a promising alternative. These technologies enable nucleic acid amplification at a constant temperature without the need for thermal cycling， making them more adaptable for different diagnostic settings. This comprehensive review examines the latest advancements in isothermal amplification technologies for virus detection. It covers various aspects， including viral sample collection， nucleic acid extraction， and isothermal amplification detection. The review explores the principles， key parameters， and applications of enzyme-assisted isothermal amplification， enzyme-free isothermal amplification， and cascade amplification techniques integrated with multiple systems. Furthermore， a comparison of commercially available reagent kits is provided to highlight their respective characteristics. Additionally， the review discusses the current challenges faced by isothermal nucleic acid amplification technologies in pathogen detection， such as extraction efficiency， stability， and cost， and proposes future directions to enhance the on-site diagnostic efficacy of these technologies.

Key words: Isothermal amplification technology, CRISPR assay, Nucleic acid amplification, Environmental viruses, Virus detection

中图分类号:

TrendMD:

肖航, 王小燕, 邓兆佳, 廖文静, 谢文菁, 彭汉勇. 核酸等温扩增技术在病毒检测中的应用. 高等学校化学学报, 2024, 45(7): 20240139.

XIAO Hang, WANG Xiaoyan, DENG Zhaojia, LIAO Wenjing, XIE Wenjing, PENG Hanyong. Development of Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies for Virus Detection. Chem. J. Chinese Universities, 2024, 45(7): 20240139.

图/表 9

Fig.2 RPA⁃based virus detection method(A) Label⁃free in situ isothermal RPA amplification in electrochemical sensors[67]. Copyright 2019, American Chemical Society; (B) fluorescence detection of RT⁃RPA incorporated PfAgo enzyme[68]. Copyright 2022, American Chemical Society.

Table 1 Summary of isothermal amplification methods

Method	Enzymes	Temperature/℃	Reaction time/h	Efficiency	Ref.
NASBA	2	ca. 41	1.5—2	10⁶—10⁹	［73］
RCA	2	60—65	1—3	10³—10⁹	［76］
SDA	2	37—70	2	10⁷	［74］
LAMP	1	60—65	1—2	10⁷—10⁹	［56］
HDA	2	37—65	0.5—2	10⁶	［80］
RPA	3	37—42	0.5—1.5	10⁷—10⁹	［57］
EXPAR	2	60	<0.5	10⁶—10⁸	［58］
CHA	—	25—37	1	7000（two layers）	［85］
HCR	—	25—37	—	—	［83］
EDC	—	25—37	1	—	［84］

Fig.6 Enzyme⁃free nucleic acid isothermal amplification and CRISPR⁃Cas cascades（A） HCR and CRISPR-Cas12a system for TCSV and HepBV detection［104］. Copyright 2021， American Chemical Society；（B） CHA-Cas13a assay for SARS-CoV-2 detection［106］. Copyright 2023， American Chemical Society.

Fig.7 RPA and CRISPR⁃Cas based multiplex detection of viruses(A) CRISPR⁃Cas multiplexed diagnostic assay for hrHPV detection [110]. Copyright 2024, American Chemical Society; (B) one⁃pot CRISPR⁃based “green⁃yellow⁃red” multiplex detection CHA⁃Cas13a assay for SARS⁃CoV⁃2 detection [111]. Copyright 2024, American Chemical Society.

Table 2 Summary of reagent kits and assay methods based on isothermal amplification technology

Product	Technique	Target	Cost	Testing time	Type	Biotech company	Ref.
NucliSens EasyQ	NASBA	virus RNA	$50， 000	1 h	Automated analysis methods	Biomeriux	［128］
OligoC⁃TesT	NASBA	Leishmania parasites DNA	$26/test	1 h	Kit	Coris Bio Concept， Belguim	［126］
BESt Cassette Type II	HDA	Staphylococcus aureus DNA	$10/test	1 h	Kit	BioHelix， USA	［129］
Illumigene（Alethia）	LAMP	Clostridium difficile DNA	$30.6/test	40 min	Kit	Meridian Bioscience， USA	［130］
Loopamp MTBC Detection Kit^®	LAMP	Mycobacterium tuberculosis DNA	$5.7/test	30 min	Kit	Eiken Chemical Co， Japan	［131］
Eazyplex^®	LAMP	Bacterial pathogens	—	30 min	Kit	Amplex Diagnostics GmbH， Germany	［123］
3M^TM Molecular Detection System	LAMP	Salmonella DNA	—	75 min	Kit	3M， USA	［132］
Genie III	LAMP	Ebola virus RNA	$13， 000	15-20 min	Automated analysis methods	OptiGene， UK	［133］
Solana^®	HDA	Trichomonas DNA	—	1 h	Kit	Quidel Corporation， USA	［79］
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核酸等温扩增技术在病毒检测中的应用

Development of Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies for Virus Detection

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