外泌体分离和蛋白质组学分析的研究进展

doi:10.7503/cjcu20240305

摘要/Abstract

摘要：

外泌体是多泡体与细胞质膜融合时释放的细胞外囊泡，含有蛋白质、脂质和核酸等. 它以细胞外囊泡的形式运送货物，参与多种癌症过程（如侵袭和转移），被认为是液体活检的新兴靶标，其在细胞通讯、信号传导和免疫应答中发挥着重要的作用. 质谱法已成为蛋白质组学研究领域不可或缺的一部分，外泌体的蛋白质组学分析是发现潜在癌症生物标志物的一种很有前途的方法. 高分辨率分离、高效质谱分析和全蛋白质组数据库的最新进展都有助于患者样本中外泌体的成功分析. 本文综合评述了外泌体的分离方法、蛋白质组学分析技术以及基于外泌体的蛋白质组学分析在临床疾病诊断的应用研究. 最后，对外泌体分离和蛋白质组学面临的挑战及在临床应用中的前景进行了展望.

关键词: 外泌体, 蛋白质组学, 质谱, 生物标志物, 疾病诊断

Abstract:

Exosomes are extracellular vesicles released via the fusion of multivesicular bodies with the cell plasma membrane， containing proteins， lipids， nucleic acids， etc. They transport cargo in the form of extracellular vesicles and participate in various cancer processes such as invasion and metastasis. As emerging targets for liquid biopsy， exosomes play crucial roles in cell communication， signal transduction， and immune response. Mass spectrometry has become an indispensable part of the field of proteomics research， and the proteomic analysis of exosomes is a promising method for discovering potential cancer biomarkers. Recent advances in high‐resolution separations， high‐performance mass spectrometry and comprehensive proteome databases have all contributed to the successful analysis of exosomes from patient samples. Here， this article reviews the isolation methods of exosomes， proteomics analysis techniques， and the application research of proteomics analysis based on exosomes in clinical disease diagnosis. Finally， the challenges faced by exosome isolation and proteomics， as well as the prospects for their clinical applications， are discussed and outlooked.

Key words: Exosome, Proteomics, Mass spectrometry, Biomarker, Disease diagnosis

中图分类号:

O657

TrendMD:

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图/表 13

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105	Castillo J.， Bernard V.， San Lucas F. A.， Allenson K.， Capello M.， Kim D. U.， Gascoyne P.， Mulu F. C.， Stephens B. M.， Huang J.， Wang H.， Momin A. A.， Jacamo R. O.， Katz M.， Wolff R.， Javle M.， Varadhachary G.， Wistuba II， Hanash S.， Maitra A.， Alvarez H.， Ann. Oncol.， 2018， 29（1）， 223—229
106	Melo S. A.， Luecke L. B.， Kahlert C.， Fernandez A. F.， Gammon S. T.， Kaye J.， LeBleu V. S.， Mittendorf E. A.， Weitz J.， Rahbari N.， Reissfelder C.， Pilarsky C.， Fraga M. F.， Piwnica⁃Worms D.， Kalluri R.， Nature， 2015， 523（7559）， 177—182
107	Hoshino A.， Kim H. S.， Bojmar L.， Gyan K. E.， Cioffi M.， Hernandez J.， Zambirinis C. P.， Rodrigues G.， Molina H.， Heissel S.， Mark M. T.， Steiner L.， Benito⁃Martin A.， Lucotti S.， di Giannatale A.， Offer K.， Nakajima M.， Williams C.， Nogues L.， Pelissier Vatter F. A.， Hashimoto A.， Davies A. E.， Freitas D.， Kenific C. M.， Ararso Y.， Buehring W.， Lauritzen P.， Ogitani Y.， Sugiura K.， Takahashi N.， Aleckovic M.， Bailey K. A.， Jolissant J. S.， Wang H.， Harris A.， Schaeffer L. M.， Garcia⁃Santos G.， Posner Z.， Balachandran V. P.， Khakoo Y.， Raju G. P.， Scherz A.， Sagi I.， Scherz⁃Shouval R.， Yarden Y.， Oren M.， Malladi M.， Petriccione M.， de Braganca K. C.， Donzelli M.， Fischer C.， Vitolano S.， Wright G. P.， Ganshaw L.， Marrano M.， Ahmed A.， DeStefano J.， Danzer E.， Roehrl M. H. A.， Lacayo N. J.， Vincent T. C.， Weiser M. R.， Brady M. S.， Meyers P. A.， Wexler L. H.， Ambati S. R.， Chou A. J.， Slotkin E. K.， Modak S.， Roberts S. S.， Basu E. M.， Diolaiti D.， Krantz B. A.， Cardoso F.， Simpson A. L.， Berger M.， Rudin C. M.， Simeone D. M.， Jain M.， Ghajar C. M.， Batra S. K.， Stanger B. Z.， Bui J.， Brown K. A.， Rajasekhar V. K.， Healey J. H.， de Sousa M.， Kramer K.， Sheth S.， Baisch J.， Pascual V.， Heaton T. E.， La Quaglia M. P.， Pisapia D. J.， Schwartz R.， Zhang H.， Liu Y.， Shukla A.， Blavier L.， DeClerck Y. A.， LaBarge M.， Bissell M. J.， Caffrey T. C.， Grandgenett P. M.， Hollingsworth M. A.， Bromberg J.， Costa⁃Silva B.， Peinado H.， Kang Y.， Garcia B. A.， O'Reilly E. M.， Kelsen D.， Trippett T. M.， Jones D. R.， Matei I. R.， Jarnagin W. R.， Lyden D.， Cell， 2020， 182（4）， 1044—1061
108	Han Z.， Peng C.， Yi J.， Wang Y.， Liu Q.， Yang Y.， Long S.， Qiao L.， Shen Y.， iScience， 2021， 24（8）， 102906
109	Wang S.， He Y.， Lu J.， Wang Y.， Wu X.， Yan G.， Fang X.， Liu B.， ACS Appl. Mater. Interfaces， 2022， 14（32）， 36341—36352
110	Wang S.， He Y.， Tian T.， Lu J.， Lu Y.， Huang X.， Zou Y.， Zhang L.， Fang X.， Liu B.， Anal. Chem.， 2023， 95（41）， 15276—15285
111	Yuyama K.， Sun H.， Fujii R.， Hemmi I.， Ueda K.， Igeta Y.， Brain， 2024， 147（2）， 627—636
112	Hunter T.， Cell， 2000， 100， 113—127
113	Chen I. H.， Xue L.， Hsu C. C.， Paez J. S.， Pan L.， Andaluz H.， Wendt M. K.， Iliuk A. B.， Zhu J. K.， Tao W. A.， Proc. Natl. Acad. Sci. USA， 2017， 114（12）， 3175—3180
114	Andaluz Aguilar H.， Iliuk A. B.， Chen I. H.， Tao W. A.， Nat. Protoc.， 2020， 15（1）， 161—180
115	Wang N.， Song X.， Liu L.， Niu L.， Wang X.， Song X.， Xie L.， Cancer Sci.， 2018， 109（5）， 1701—1709
116	Uzzaman A.， Zhang X.， Qiao Z.， Zhan H.， Sohail A.， Wahid A.， Shang Z.， Guan X.， Cao C. X.， Xiao H.， Biochimie， 2020， 177， 132—141
117	Li C.， Zhou Y.， Liu J.， Su X.， Qin H.， Huang S.， Huang X.， Zhou N.， Cancer Epidem. Biomar.， 2019， 28（10）， 1668—1681
118	Zhang W.， Ou X.， Wu X.， Int. J. Oncol.， 2019， 54， 1719—1733
119	Panigrahi G. K.， Praharaj P. P.， Kittaka H.， Mridha A. R.， Black O. M.， Singh R.， Mercer R.， van Bokhoven A.， Torkko K. C.， Agarwal C.， Agarwal R.， Abd Elmageed Z. Y.， Yadav H.， Mishra S. K.， Deep G.， Cancer Med.， 2019， 8（3）， 1110—1123
120	Wang X.， Tian L.， Lu J.， Ng I. O. L.， Oncogenesis， 2022， 11（1）， 54
121	Chen G.， Huang A. C.， Zhang W.， Zhang G.， Wu M.， Xu W.， Yu Z.， Yang J.， Wang B.， Sun H.， Xia H.， Man Q.， Zhong W.， Antelo L. F.， Wu B.， Xiong X.， Liu X.， Guan L.， Li T.， Liu S.， Yang R.， Lu Y.， Dong L.， McGettigan S.， Somasundaram R.， Radhakrishnan R.， Mills G.， Lu Y.， Kim J.， Chen Y. H.， Dong H.， Zhao Y.， Karakousis G. C.， Mitchell T. C.， Schuchter L. M.， Herlyn M.， Wherry E. J.， Xu X.， Guo W.， Nature， 2018， 560（7718）， 382—386
122	Garcia⁃Silva S.， Benito⁃Martin A.， Sanchez⁃Redondo S.， Hernandez⁃Barranco A.， Ximenez⁃Embun P.， Nogues L.， Mazariegos M. S.， Brinkmann K.， Amor Lopez A.， Meyer L.， Rodriguez C.， Garcia⁃Martin C.， Boskovic J.， Leton R.， Montero C.， Robledo M.， Santambrogio L.， Sue Brady M.， Szumera⁃Cieckiewicz A.， Kalinowska I.， Skog J.， Noerholm M.， Munoz J.， Ortiz⁃Romero P. L.， Ruano Y.， Rodriguez⁃Peralto J. L.， Rutkowski P.， Peinado H.， J. Exp. Med.， 2019， 216（5）， 1061—1070
123	Hirschberg Y.， Valle⁃Tamayo N.， Dols⁃Icardo O.， Engelborghs S.， Buelens B.， Vandenbroucke R. E.， Vermeiren Y.， Boonen K.， Mertens I.， J. Extracell. Vesicles， 2023， 12（12）， e12383
124	Zhang J.， Guan M.， Lv M.， Liu Y.， Zhang H.， Zhang Z.， Zhang K.， ACS Nano， 2023， 17（20）， 20120—20134
125	Vyhlídalová Kotrbová A.， Gömöryová K.， Mikulová A.， Plešingerová H.， Sladeček S.， Kravec M.， Hrachovinová Š.， Potěšil D.， Dunsmore G.， Blériot C.， Bied M.， Kotouček J.， Bednaříková M.， Hausnerová J.， Minář L.， Crha I.， Felsinger M.， Zdráhal Z.， Ginhoux F.， Weinberger V.， Bryja V.， Pospíchalová V.， J. Extracell. Vesicles， 2024， 13（3）， e12420

Type	Name	Labeling level	Beneficial feature	Limitation
Metabolic labeling	SILAC	Cells， organisms	Efficient labeling， one label for（tryptic） peptide， semiautomatic data analysis Applicable to cells but can be expanded to tissues or model organisms using internal standards （e.g.， super⁃SILAC）	High costs， especially when applied to whole organisms Super⁃SILAC experiments have reduced quantitative proteome coverage Requires metabolically active cells to introduce labels
Metabolic labeling	15N labeling	Cells， organisms	Efficient labeling Applicable to cells and model organisms	Expensive Complex data analysis Limited multiplexing capability（up to 2⁃plex） Not suitable for clinical samples
Chemical labeling （in vitro） ⁃isobaric labeling	iTRAQ	Peptide	Efficient labeling enhanced signal intensity in MS and MS/MS， high multiplexing capability， simple data analysis Applicable to any sample（cells， animal or human tissue） Commercially available	Expensive Does not allow in vivo labeling Quantitative precision dependent on the reproducibility of sample preparation
Chemical labeling （in vitro） ⁃isobaric labeling	TMT	Peptide	Efficient labeling enhanced signal intensity in MS and MS/MS， high multiplexing capability， simple data analysis Applicable to any sample（cells， animal or human tissue）	Expensive Requires fragmentation with HCD or ETD Does not allow in vivo labeling Quantitative precision dependent on the reproducibility of sample preparation
Type	Name	Labeling level	Beneficial feature	Limitation
Enzymatic labeling （in vitro）	¹⁸O labeling	Peptide	Low costs， simple in handling Applicable to any sample（cells， animal or human tissue）	Incomplete labeling complicates data analysis Limited multiplexing capability（up to 2⁃plex） Not suitable for in vivo labeling Overlapping isotopic peaks Varied labeling efficiencies
Label⁃free	Spectral counting	NA	Low costs， simple in handling Broad applicability	Less accurate than the labeling methods More time needed for MS analysis
Label⁃free	Chromatographic peak area	NA	Low costs， simple in handling Broad applicability	Less accurate than the labeling methods More time needed for MS analysis

Type	Name	Labeling level	Beneficial feature	Limitation
Metabolic labeling	SILAC	Cells， organisms	Efficient labeling， one label for（tryptic） peptide， semiautomatic data analysis Applicable to cells but can be expanded to tissues or model organisms using internal standards （e.g.， super⁃SILAC）	High costs， especially when applied to whole organisms Super⁃SILAC experiments have reduced quantitative proteome coverage Requires metabolically active cells to introduce labels
Metabolic labeling	15N labeling	Cells， organisms	Efficient labeling Applicable to cells and model organisms	Expensive Complex data analysis Limited multiplexing capability（up to 2⁃plex） Not suitable for clinical samples
Chemical labeling （in vitro） ⁃isobaric labeling	iTRAQ	Peptide	Efficient labeling enhanced signal intensity in MS and MS/MS， high multiplexing capability， simple data analysis Applicable to any sample（cells， animal or human tissue） Commercially available	Expensive Does not allow in vivo labeling Quantitative precision dependent on the reproducibility of sample preparation
Chemical labeling （in vitro） ⁃isobaric labeling	TMT	Peptide	Efficient labeling enhanced signal intensity in MS and MS/MS， high multiplexing capability， simple data analysis Applicable to any sample（cells， animal or human tissue）	Expensive Requires fragmentation with HCD or ETD Does not allow in vivo labeling Quantitative precision dependent on the reproducibility of sample preparation
Type	Name	Labeling level	Beneficial feature	Limitation
Enzymatic labeling （in vitro）	¹⁸O labeling	Peptide	Low costs， simple in handling Applicable to any sample（cells， animal or human tissue）	Incomplete labeling complicates data analysis Limited multiplexing capability（up to 2⁃plex） Not suitable for in vivo labeling Overlapping isotopic peaks Varied labeling efficiencies
Label⁃free	Spectral counting	NA	Low costs， simple in handling Broad applicability	Less accurate than the labeling methods More time needed for MS analysis
Label⁃free	Chromatographic peak area	NA	Low costs， simple in handling Broad applicability	Less accurate than the labeling methods More time needed for MS analysis

Disease	Sample	Type of MS	Potential finding	Ref.
Pancreatic ductal adenocarcinoma	Plasma	LC⁃MS/MS	CLDN4， EPCAM， CD151， LGALS3BP， HIST2H2BE and HIST2H2BF	［105］
Multiple cancers	Tissue explants， plasma， and other bodily fluids	LC⁃MS/MS， DDA	ACTB， MSN and RAP1B	［107］
Osteosarcoma	Plasma	LC⁃MS/MS， MALDI⁃TOF MS	IGLV2⁃23， IGLV4⁃3， IGLV1⁃51， IGKV3⁃15， IGHV4⁃4， IGLV4⁃60， HBA1	［108］
Prostate cancer	Serum	LC⁃MS/MS	Vinculin， ECM， Rac， VASP	［110］
Alzheimer	Cerebrospinal fluid， plasma	Orbitrap， LC⁃MS	Cathepsin B	［111］
Breast cancer	Plasma	LC⁃MS/MS， label⁃free	144 Phosphoproteins	［113］
Colorectal cancer	Serum	DIA， TMT	Fibrinogen α chain， phosphorylated fibronectin 1， haptoglobin	［81］
Hepatocellular carcinoma	Serum	DDA， DIA	Von Willebrand factor， LGALS3BP， TGFB1， SERPINC1， HPX， HP， HBA1， FGA， FGG， FGB	［80］
Lung cancer	Serum	UPLC⁃MS/MS， Q⁃exactive	Lipopolysaccharide⁃binding proteins	［115］
Liver cancer	Serum	LC‐MS， LTQ⁃orbitrap XL	Thrombospondin⁃1， fibulin⁃1， fibrinogen gamma chain	［116］
Oral squamous cell carcinoma	Serum	LC⁃MS， Q‐exactive， orbitrap	PF4V1， CXCL7， F13A1， ApoA1	［117］
Epithelial ovarian cancer	Plasma	LC‐MS/MS， TMT	Fibrinogen alpha chain， fibrinogen alpha chain	［118］
Prostate cancer	Serum	LC‐MS/MS	Filamin A	［119］

Disease	Sample	Type of MS	Potential finding	Ref.
Pancreatic ductal adenocarcinoma	Plasma	LC⁃MS/MS	CLDN4， EPCAM， CD151， LGALS3BP， HIST2H2BE and HIST2H2BF	［105］
Multiple cancers	Tissue explants， plasma， and other bodily fluids	LC⁃MS/MS， DDA	ACTB， MSN and RAP1B	［107］
Osteosarcoma	Plasma	LC⁃MS/MS， MALDI⁃TOF MS	IGLV2⁃23， IGLV4⁃3， IGLV1⁃51， IGKV3⁃15， IGHV4⁃4， IGLV4⁃60， HBA1	［108］
Prostate cancer	Serum	LC⁃MS/MS	Vinculin， ECM， Rac， VASP	［110］
Alzheimer	Cerebrospinal fluid， plasma	Orbitrap， LC⁃MS	Cathepsin B	［111］
Breast cancer	Plasma	LC⁃MS/MS， label⁃free	144 Phosphoproteins	［113］
Colorectal cancer	Serum	DIA， TMT	Fibrinogen α chain， phosphorylated fibronectin 1， haptoglobin	［81］
Hepatocellular carcinoma	Serum	DDA， DIA	Von Willebrand factor， LGALS3BP， TGFB1， SERPINC1， HPX， HP， HBA1， FGA， FGG， FGB	［80］
Lung cancer	Serum	UPLC⁃MS/MS， Q⁃exactive	Lipopolysaccharide⁃binding proteins	［115］
Liver cancer	Serum	LC‐MS， LTQ⁃orbitrap XL	Thrombospondin⁃1， fibulin⁃1， fibrinogen gamma chain	［116］
Oral squamous cell carcinoma	Serum	LC⁃MS， Q‐exactive， orbitrap	PF4V1， CXCL7， F13A1， ApoA1	［117］
Epithelial ovarian cancer	Plasma	LC‐MS/MS， TMT	Fibrinogen alpha chain， fibrinogen alpha chain	［118］
Prostate cancer	Serum	LC‐MS/MS	Filamin A	［119］

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