分裂内含肽： 一种高效的无痕多肽片段连接工具

doi:10.7503/cjcu20230188

摘要/Abstract

摘要：

分裂内含肽通过剪接反应实现多肽片段的连接，具有高效且无痕的特点，受到了广泛关注. 本文基于分裂内含肽的结构特征与剪接反应过程，结合近年来关于分裂内含肽性能优化和应用研究进展进行了综合评述，揭示其作为一种日渐成熟的蛋白质工程化技术在蛋白质化学合成领域的前景，并简要分析了目前分裂内含肽工具面临的问题与挑战，并对可能的解决方案进行了展望.

关键词: 分裂内含肽, 蛋白质剪接反应, 定点修饰, 蛋白质化学合成, 多肽片段连接

Abstract:

Split intein can efficiently ligate peptide segments via a splicing reaction in a traceless manner and therefore has attracted great attention. Based on the structural characteristics and splicing reaction process of split intein， this paper comprehensively reviewed the recent progresses on the performance optimization and expanded applications of split intein， and revealed its great potential in the field of chemical protein synthesis as an increasingly sophisticated protein engineering technology. Finally， the challenges presented in the split intein- mediated protein trans-splicing and potential solutions in the future research were briefly discussed.

Key words: Split intein, Protein splicing reaction, Site-specific modification, Chemical protein synthesis, Peptide ligation

中图分类号:

O621

TrendMD:

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图/表 20

Fig.1 Ligation of protein fragments（A） Protein fragments ligation；（B） sortase ligation；（C） native chemical ligation（NCL）.

Fig.2 Sequence characteristics of InteinsThe Intein sequence is flanked by two exteins. The N-terminal peptide contains A and B structural motifs， and the C-terminal peptide contains F and G motifs. A-block usually has Cys or Ser as a conservative residue. Zone B usually contains His and Thr residues， while Zone F usually contains Asp and His. In addition， G-Block has two conservative residues； the penultimate His and the last Asn.

Fig.3 Principle of protein trans⁃splicing by split inteinThe N⁃terminal and C⁃terminal segments of the split intein were connected with the two segments of the host protein respectively， and the complete mature host protein was obtained by splicing reaction. The orange area in the figure is the connection position between the intein and the extein. The amino acid sequence at this position greatly impacts the splicing efficiency.

Table 1 Previously reported artificial split intein

Host protein	Species	N⁃flanking sequence	C⁃ flanking sequence	Acyl transfer residues	Ref.
DnaB	Rma	LRESG/C	AHN/SIEQDA	CS	［43］
GyrB	Ssp	DSAGG/C	FVHN/SAKQG	CS	［43］
DnaB	Ssp	LRESG/C	VHN/SIEQD	CS	［44］
VMA	Sce	RGTLE/C	VVVHN/CG	CC	［45］
RIR1	Pfu⁃site1	GGG/C	HN/TGL	CT	［46］
RIR1	Pfu⁃site2	TNP/C	SHN/CGEE	CC	［47］
GB⁃D pol1	Psp	GTLEA/SILPEE	LYAHN/SGLNS	SS	［41］
RecA	Mtu	VVVKNK/C	VVVHN/CSPPFK	CC	［42］
DnaE	Ter（TerDnaE⁃3）	TYGVL/C	VVVHN/CYQEQY	CC	［48］

Table 2 General naturally split intein from different species

Host protein	Species	N⁃flanking sequence	C⁃flanking sequence	Acyl transfer residue	Ref.
DnaE	Ssp	FDQMVKFAEY/C	AN/CFNKSHSTAY	CC	［49］
DnaE	Npu	FEQMLKFAEY/C	SN/CFNKSHSTAY	CC	［51］
DnaE	Nsp	FDDMLKFAEY/C	SN/CFNKSHSTAY	CC	［52］
DnaE	Asp	FDDMLKFAEY/C	SN/CFNKSHSTAY	CC	［53］
DnaE	Oli	FEQMVKFAEY/C	SN/CFNKSHSMAY	CC	［52］
DnaE	Tvu	DFAEY/C	AN/CFNKSHSTAY	CC	［52］
DnaE	Thermococcus kodakarensis KOD1	KILAN/SIL	AHN/SYYGY	SS	［54］
B⁃type DNA polymerase	Neq	EEGFKVIYGD/S	HN/TDSLFISGDK	ST	［55］
NrdJ	（GOS）^*	GTNPC/C	HN/SEIVL	CS	［56］
gp41	（GOS）^*	TRSGY/C	HN/SSSDV	CS	［56］
gp41	（GOS）^*	SQLNR/C	HN/SAVEE	CS	［56］
IMPDH	（GOS）^*	GIGGG/C	HN/SICST	CS	［56］
Vidal T4Lh⁃1		LAS/C	SHN/TNVG	CT	［57］
Vidal UvsX⁃2		ESG/C	SHN/SGK	CS	［16］
NrdHF	（GOS∶AceL） ^a	SIRDE/A	TGN/SMHVE	Class3 ^b CS	［58］
TerL	（GOS∶AceL） ^a	EFE/C	SHN/CEFL	CC	［59］

Fig.4 General structure and different split sites of split intein complex（A） Crystal structure of Npu DnaB（PDB code 4OIR）； orange represents β-sheets that form the horseshoe-like plane； cyan represents the ββα motif， yellow represents vertical β-sheets connecting to the C-extein；（B） crystal structure of Ssp DnaE（PDB code 3NZM） and NMR solution structure of Cat（PDB code 6DSL）； green represents N-intein and blue represents C-intein；（C） scheme of the general secondary structure of split intein complex， colored corresponding to structure in （A）.

Fig.5 Combination of split inteinGray represents disordered or dynamic structure. Green represents stable folded structure. Purple and red represents N-extein and C-extein， respectively.

Fig.6 Mechanism of protein trans⁃splicing mediated by split inteinPink and purple square represents N-extein and C-extein respectively.

Fig.7 Catalytic environment of protein trans⁃splicing mediated by split inteinThe first step(A), the second step(B) and the third step(C) of protein trans⁃splicing are described by crystal structures on the left side and the mechanism schemes on the right side. (A) Uses the crystal structure of Ssp DnaE(PDB code 3NZM); (B) and (C) use the crystal structure of Npu DnaE(PDB code 4 KL5).

Fig.8 Sequence evolution processA large number of randomly mutated genes obtained from error-prone PCR were screened to obtain the mutated peptide sequence that can perform splicing reaction at the insertion site.

Fig.9 Compatibility of extein+2 positionCompared with WT， the split intein mutation in the ring（residue 122-124） where His125 is located led to a faster reaction rate to different extein +2 amino acid residue.

Fig.10 Compatibility of extein+2 positionCompared with WT， the split endopeptides modified by mutation in key regions generally have higher splicing yield for different exopeptides+2 amino acid residues except for F.

Fig.11 The application of the orthogonal split intein in the multi⁃segment one⁃pot ligation[87]Through five groups of mutually orthogonal split inteins， the sequential ligation of six large proteins was achived in a one-pot manner.

Fig.12 The tPTS strategy implements three⁃segment splicing

Fig.13 Potential divisible sites in the intein sequenceMost of the natural split inteins split from S0. Researchers have tried to develop a variety of atypical split intein from other potential split sites.

Fig.14 N⁃terminal(A) or C⁃terminal(B) modification of proteins via the split intein peptide⁃mediated PTS

Fig.15 Split intein⁃mediated protein fragment isotope labeling

Fig.16 Split intein⁃mediated peptide cyclization

Fig.17 Small molecule induced CPS system(A) and light induced CPS system(B)

Fig.18 Reactivation of CPS system

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