Mass Spectrometry-based Deep Coverage Proteome： Evaluation of Cellular Protein Extraction Methods

doi:10.7503/cjcu20240344

Abstract

Abstract:

The current study comprehensively evaluates four different protein extraction methods based on urea， sodium dodecyl sulfate（SDS）， anionic surfactants（BT）， and total RNA extractor（Trizol）， aiming to optimize the sample preparation workflow for mass spectrometry-based proteomics. Using HeLa cells as an example， we found that the method employing the mass spectrometry-compatible surfactant BT reagent significantly reduces the total time consumed for protein extraction and minimizes protein losses during the sample preparation process. Further integrating the four protein extraction methods， we identified over 7000 proteins from HeLa cells without relying on pre-fractionation techniques， and 2990 of them were quantified using label-free quantification. It is worth noting that the BT and SDS methods demonstrate higher efficiency in extracting membrane proteins， while the Urea and Trizol methods are more effective in extracting proteins from nuclear and cytoplasmic fractions. In summary， this study provides a novel solution for deep proteome coverage， particularly in the context of cellular protein extraction， by integrating mass spectrometry-compatible surfactants with traditional extraction methods to effectively enhance protein identification numbers.

Key words: Surfactant, Protein extraction, Proteomics, Mass spectrometry

CLC Number:

O651

TrendMD:

XU Xia, QIN Weida, LI Ruomeng, WANG Qianqian, LIU Ning, LI Gongyu. Mass Spectrometry-based Deep Coverage Proteome： Evaluation of Cellular Protein Extraction Methods[J]. Chem. J. Chinese Universities, 2024, 45(11): 20240344.

Figures/Tables 4

Table 1 Information for four protein extraction methods

Abb.	Full name	Lysis buffer	Clean⁃up method	Time
Urea（U）	Urea⁃based Protein Extraction	50 mmol/L Tris buffer， 8 mol/L urea， 5 mmol/L CaCl₂， 30 mmol/L NaCl	C₁₈ SepPak desalting	ca. 10 h
SDS（S）	Surfactant and Chaotropic Agent Assisted Sequential Extraction/On⁃Pellet Digestion	50 mmol/L Tris buffer， 4% SDS	80% Acetone precipitation+C₁₈ SepPak desalting	ca. 22 h
Trizol（T）	Trizol， Total RNA Extractor	Trizol， chloroform	Evaporation+C₁₈ SepPak desalting	ca. 13 h
BT（B）	BT Surfactant	50 mmol/L NH₄HCO₃， 3% BT	pH=2.3—3.0， 45 ℃， On⁃filter degradation， desalting⁃free	ca. 1 h

Fig.1 BT⁃based proteomics workflow

Fig.2 Performance checking on different protein extraction methods, Urea(U), SDS(S), BT(B) and Trizol(T)（A） Representative SDS-PAGE characterization of extracted proteins；（B） peptide yield from the same amount of starting materials；（C） protein abundance distribution；（D） protein sequence coverage；（E） Venn diagram for protein IDs；（F） unique protein ID；（G） unique peptide ID and （H） BT- and Trizol-enhanced protein identification. All data are from triplicate biological replicates with error bars showing standard deviation.

Fig.3 Protein profiles with different extraction methods（A） Hierarchical clustering of 2990 quantified proteins and four clusters of these proteins are depicted on different intensity profiles；（B） the number of proteins and cellular components in each cluster was marked；（C） the volcano plot illustrates the pairwise comparison of protein expression levels between different methods. Dots above the horizontal dashed line represent significantly altered proteins（two-sided t-test， P value<0.05， adjusted for multiple comparisons using the Benjamini-Hochberg method）. Downregulated proteins， indicated by green color， while upregulated proteins are represented by red color（protein fold change>2）.

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