深度覆盖蛋白质组学质谱分析： 细胞蛋白提取方法的评估

doi:10.7503/cjcu20240344

摘要/Abstract

摘要：

综合评估了分别基于尿素(Urea)、十二烷基硫酸钠(SDS)、阴离子表面活性剂(BT)和新型总RNA抽提试剂(Trizol)的蛋白质提取方法，旨在优化基于质谱的蛋白质组学的样品制备流程. 以HeLa细胞为例，利用与质谱兼容的表面活性剂BT可显著缩短提取蛋白质的总时间，减少样品制备过程中蛋白质的损失. 整合了4种蛋白质提取方法，在不依赖柱前分馏技术的前提下，从HeLa细胞中鉴定出超过7000个蛋白质；并采用无标定量的方法定量测定了其中2990个蛋白质. 值得注意的是， BT法和SDS法在提取膜蛋白方面具有更高的效率，而Urea法和Trizol法在提取细胞核和细胞质组分方面更有效. 研究结果为深度覆盖蛋白质组学提供了蛋白质提取的新型解决方案，尤其在细胞蛋白提取方面，通过整合质谱兼容型表面活性剂与传统提取方法，有效提升了蛋白质鉴定数.

关键词: 表面活性剂, 蛋白提取, 蛋白质组学, 质谱

Abstract:

The current study comprehensively evaluates four different protein extraction methods based on urea， sodium dodecyl sulfate（SDS）， anionic surfactants（BT）， and total RNA extractor（Trizol）， aiming to optimize the sample preparation workflow for mass spectrometry-based proteomics. Using HeLa cells as an example， we found that the method employing the mass spectrometry-compatible surfactant BT reagent significantly reduces the total time consumed for protein extraction and minimizes protein losses during the sample preparation process. Further integrating the four protein extraction methods， we identified over 7000 proteins from HeLa cells without relying on pre-fractionation techniques， and 2990 of them were quantified using label-free quantification. It is worth noting that the BT and SDS methods demonstrate higher efficiency in extracting membrane proteins， while the Urea and Trizol methods are more effective in extracting proteins from nuclear and cytoplasmic fractions. In summary， this study provides a novel solution for deep proteome coverage， particularly in the context of cellular protein extraction， by integrating mass spectrometry-compatible surfactants with traditional extraction methods to effectively enhance protein identification numbers.

Key words: Surfactant, Protein extraction, Proteomics, Mass spectrometry

中图分类号:

O651

TrendMD:

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图/表 4

Table 1 Information for four protein extraction methods

Abb.	Full name	Lysis buffer	Clean⁃up method	Time
Urea（U）	Urea⁃based Protein Extraction	50 mmol/L Tris buffer， 8 mol/L urea， 5 mmol/L CaCl₂， 30 mmol/L NaCl	C₁₈ SepPak desalting	ca. 10 h
SDS（S）	Surfactant and Chaotropic Agent Assisted Sequential Extraction/On⁃Pellet Digestion	50 mmol/L Tris buffer， 4% SDS	80% Acetone precipitation+C₁₈ SepPak desalting	ca. 22 h
Trizol（T）	Trizol， Total RNA Extractor	Trizol， chloroform	Evaporation+C₁₈ SepPak desalting	ca. 13 h
BT（B）	BT Surfactant	50 mmol/L NH₄HCO₃， 3% BT	pH=2.3—3.0， 45 ℃， On⁃filter degradation， desalting⁃free	ca. 1 h

Fig.1 BT⁃based proteomics workflow

Fig.2 Performance checking on different protein extraction methods, Urea(U), SDS(S), BT(B) and Trizol(T)（A） Representative SDS-PAGE characterization of extracted proteins；（B） peptide yield from the same amount of starting materials；（C） protein abundance distribution；（D） protein sequence coverage；（E） Venn diagram for protein IDs；（F） unique protein ID；（G） unique peptide ID and （H） BT- and Trizol-enhanced protein identification. All data are from triplicate biological replicates with error bars showing standard deviation.

Fig.3 Protein profiles with different extraction methods（A） Hierarchical clustering of 2990 quantified proteins and four clusters of these proteins are depicted on different intensity profiles；（B） the number of proteins and cellular components in each cluster was marked；（C） the volcano plot illustrates the pairwise comparison of protein expression levels between different methods. Dots above the horizontal dashed line represent significantly altered proteins（two-sided t-test， P value<0.05， adjusted for multiple comparisons using the Benjamini-Hochberg method）. Downregulated proteins， indicated by green color， while upregulated proteins are represented by red color（protein fold change>2）.

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