刘孟, 徐毅, 杨帆, 周全, 任晶, 任瑞鹏, 吕永康

高等学校化学学报 2025, 46 (2): 20240368-. DOI:10.7503/cjcu20240368

摘要（963）

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在醋酸缓冲溶液中于室温合成了COF-LZU1，并用于固定化漆酶和辣根过氧化物酶. 通过优化反应浓度、时间、缓冲溶液pH值、温度、洗涤溶剂和干燥方式等条件，在pH=4.5的醋酸缓冲溶液中，于室温下搅拌30 min，合成了具有高结晶度的COF-LZU1，其比表面积高达501 m²/g，且具有较高的热稳定性(480 ℃). 在最优反应条件下，以COF-LZU1为载体，采用原位包埋法对漆酶和辣根过氧化物酶进行固定化，并对其性质进行了研究. 实验结果表明，固定化酶的活性高达84.26%和73.66% (相对于游离酶活性)，且在循环使用10次后，其相对活性仍保持约80%. 通过多个结合位点， COF-LZU1可有效稳定酶的活性构象，使其不易发生结构变形，提高了酶的热稳定性、 pH稳定性和重复使用性等. 醋酸缓冲溶液是生化实验中常用的缓冲溶液，本研究中其既作为溶剂又作为催化剂，与现有合成方法相比，该方法更有利于提高生物分子的稳定性，并有望为固定化酶提供新的解决方案.

Fig.4 Relative activity of free Lac and Lac@COF⁃LZU1(A), free HRP and HRP@COF⁃LZU1(B) at different temperatures, relative activity of free Lac and Lac@COF⁃LZU1(C), free HRP and HRP@COF⁃LZU1(D) at different pH values, relative activity of free Lac and Lac@COF⁃LZU1(E), free HRP and HRP@COF⁃LZU1 in different environments(F)

由图S4（见本文支持信息）可见， COF-LZU1在1580 cm-1处显示出强的C=N伸缩峰，表明形成了亚胺键. 与反应物BTCA和PA的FTIR谱图相比， COF-LZU1的醛基带（1620 cm?1）和氨基带（3420 cm?1）明显减弱且略有偏移，这是因为醛与伯胺缩合形成了亚胺键［26］. 1620和3420 cm?1处的峰可分别对应于COF-LZU1末端残留的醛基和氨基.

将游离酶分别置于30， 40， 50， 60， 70和80 ℃环境中恒温2 h后，测试其活性. 如图S9（A）和（B）（见本文支持信息）所示，在5 min内测定其吸光度值（OD），并计算出OD随时间（t）变化的曲线斜率，即为酶活性. 将HRP/Lac@COF-LZU1分别置于30， 40， 50， 60， 70和80 ℃环境中恒温2 h后，测试其活性. 由图4（A）可见，在40 ℃时游离Lac和Lac@COF-LZU1的活性最高；当温度低于或高于40 ℃时酶的活性下降，但游离酶失活速率更快，这是由于游离酶结构高度异变所致；而COF-LZU1作为载体，可阻止结构快速异变. 由图4（B）可见，在30 ℃时游离HRP和HRP@COF-LZU1的活性最高；当温度高于30 ℃时酶的活性下降，但固定化后酶的失活速率明显低于游离酶，稳定性更高. 这是因为COF-LZU1对酶的结构起到了保护作用，延缓了酶活性的降低.

将游离Lac/HRP分别置于pH=3， 4， 5， 6， 7， 8， 9和10的环境中恒温2 h后，测试其活性. 如图S9（C）和（D）（见本文支持信息）所示，在5 min内测定其吸光度值（OD），并计算出OD随时间（t）变化的曲线斜率，即为酶活性. 将Lac/HRP@COF-LZU1分别置于pH=3， 4， 5， 6， 7， 8， 9和10的环境中恒温2 h后，测试其活性. 由图4（C）可见，当pH=4时酶的活性最高；当pH高于或低于4时游离酶快速失活，而Lac@COF-LZU1的活性更稳定，这是因为COFs材料对酶的保护作用使活性保持稳定. 由图4（D）可见，当pH=5时酶的活性最高；当pH大于或小于5时酶的活性下降，但HRP@COF-LZU1活性的下降速率明显低于游离HRP，这是因为COF-LZU1对酶的结构具有保护作用，有利于维持酶的活性.

将游离Lac/HRP分别置于H₂O，醋酸缓冲溶液和MeOH中恒温24 h后，测试其活性. 如图S9（E）和（F）（见本文支持信息）所示，在5 min内测定其吸光度值（OD），并计算出OD随时间（t）变化的曲线斜率，即为酶活性. 由图4（E）和（F）可见，在MeOH中孵育24 h后游离Lac/HRP快速失活，而Lac/HRP@COF-LZU1仍保持活性稳定，说明COFs材料在部分有机溶剂中可维持酶的稳定性.