siRNA-1(正义链siRNA:5'-AAUCCUAACUUACUCAGCCCAGCAUCA-3',反义链siRNA:3'dTdT-UUAGGAUUGAAUGAGUCGGGUCGUAGU-5'),siRNA-2(正义链siRNA:5'-AAUUGUAACCUAAUACAAAGUGUAGCC-3',反义链siRNA:3'-dTdT-UUAACAUUGGAUUAUGUUUCACAUCGG-5')和lipoHigh脂质体购于生工生物工程(上海)股份有限公司; 3-(4, 5-二甲基噻唑-2)-2, 5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)和鱼精蛋白(Protamine from salmon, 分析纯)购于美国Sigma公司; 氢氧化钠(分析纯)购于天津市科密欧化学试剂有限公司; 过硫酸铵、 甲醛、 冰乙酸、 硝酸银和乙二胺四乙酸二钠(分析纯)购于天津市大茂化学试剂厂; 溴酚蓝(分析纯)购于天津市光复科技发展有限公司; 蔗糖(分析纯)购于天津市北方天医化学试剂厂; 6× 上样缓冲液(含质量分数0.25%的溴酚蓝、 质量分数40%的蔗糖及体积分数3%, pH=8.0, 0.5 mol/L的Na₂EDTA· 2H₂O溶液); 4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES, 分析纯)购于南京旋光科技有限公司; 氯化钠和氯化钾(分析纯)购于国药集团化学试剂有限公司; 氯化锰、 氯化钙和氯化镁(分析纯)购于天津光复科技发展有限公司; 四甲基乙二胺(TEMED, 分析纯)购于天津市光复精细化工研究所; 质量分数30%的丙烯酰胺(聚丙烯酰胺与N, N'-亚甲双丙烯酰胺质量比为29∶ 1)和β -巯基乙醇(分析纯)购于北京博奥拓达科技有限公司; 10× Tris-硼酸缓冲液(TBE)和二甲基亚砜(DMSO, 分析纯)购于北京索莱宝科技有限公司; 3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES, 分析纯)购于上海邦成化工有限公司.

DW-86L388J型超低温冰箱(青岛海尔股份有限公司); SW-CJ-2FD型超级工作台(苏州安泰空气技术有限公司); BG-gdsAUTO520型凝胶成像分析系统、 BG-ver MINI型垂直电泳槽和BG-power600h型电泳仪电源(北京百晶生物技术有限公司); IS-RDV1型摇床(美国精骐有限公司); 摩尔基因型1810S超纯水机(重庆摩尔水处理设备有限公司); Tecnai G2 F20 S-TWIN型透射电子显微镜(TEM, 美国FEI公司); Agilent 5500 AFM-SPM型原子力-扫描探针显微镜(AFM, 美国Agilent公司); Delsa Nano C 纳米粒度仪(美国Beckman Coulter 公司); 311型CO₂恒温细胞培养箱(美国Thermo Scientific公司); FV1000型激光共聚焦显微镜(日本Olympus公司); EL× 800型全自动酶标仪(美国BioTek公司).

1.2.1 鱼精蛋白-siRNA复合体的制备 取5.0 μ L用20 mmol/L HEPES缓冲液(pH=7.4)稀释的不同浓度的鱼精蛋白液, 逐滴加入到5.0 μ L 8.6675 μ g/mL siRNA-1溶液中^[24] , 在保持鱼精蛋白与siRNA-1的质量比分别为15∶ 1, 20∶ 1, 25∶ 1, 30∶ 1, 35∶ 1和40∶ 1的前提下, 用HEPES缓冲液定容至50.0 μ L, 涡旋混匀5 min, 室温下孵育30 min, 使之形成鱼精蛋白-siRNA-1复合体. 按照上述过程制备质量比分别为15∶ 1, 20∶ 1, 25∶ 1, 30∶ 1, 35∶ 1和40∶ 1的鱼精蛋白-siRNA-2复合体. 对制备的鱼精蛋白-siRNA复合体用质量分数20%的聚丙烯酰胺凝胶电泳解析分子量大小.

实验中, 质量比为20∶ 1的鱼精蛋白-siRNA-1复合体的制备基本步骤同上. 具体组方按表1进行, 在保持反应体系总体积不变的前提下, 依次增加鱼精蛋白和siRNA-1的体积.

Table 1

Table 1

Table 1 Preparation of protamine-siRNA-1 complex with a mass ratio of 20∶ 1 V(Total)/μ L V(siRNA)/μ L V(Protamine)/μ L V(HEPES)/μ L 50.0 2.5 2.5 45.0 50.0 5.0 5.0 40.0 50.0 7.5 7.5 35.0 50.0 10.0 10.0 30.0 50.0 12.5 12.5 25.0 50.0 15.0 15.0 20.0

Table 1 Preparation of protamine-siRNA-1 complex with a mass ratio of 20∶ 1

1.2.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染 聚丙烯酰胺凝胶电泳的凝胶制备、 电泳、 银染及成像参照文献[18, 25]方法.

1.2.3 鱼精蛋白与siRNA的作用方式探究 向质量比为20∶ 1的鱼精蛋白-siRNA-1复合体混合液中分别加入NaCl, KCl, CaCl₂, MnCl₂和MgCl₂, 使每种盐的最终浓度分别为0, 2.5, 5, 10, 15, 25和50 mmol/L, 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)及银染成像. 向质量比20∶ 1鱼精蛋白-siRNA-1复合体混合液中加入MgCl₂使Mg²⁺浓度分别为0, 2.5, 5, 10, 15, 25和50 mmol/L, 涡旋混匀5 min, 室温下孵育30 min后, 进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并银染成像.

1.2.4 鱼精蛋白-siRNA复合体的结构表征 取约10 μ L质量比20∶ 1和40∶ 1的鱼精蛋白-siRNA-1复合体样品滴在铜网上, 真空冷冻干燥约30 min, 用5 μ L含质量分数 2%的磷钨酸进行染色(染色时间约3 min), 从铜网侧边吸走多余染色液, 经真空冷冻干燥后, 用TEM进行观察.

参照文献[26]方法制备AFM样品, 用原子力-扫描探针显微镜进行观察.

1.2.5 鱼精蛋白-siRNA复合体粒度的测定 利用激光纳米粒度仪测定质量比为15∶ 1, 20∶ 1, 25∶ 1, 30∶ 1, 35∶ 1和40∶ 1的鱼精蛋白-siRNA-1复合体的粒径大小, 将样品适当稀释, 过滤, 置于比色皿中测试, 每个样品平行测定3次.

1.2.6 鱼精蛋白-siRNA复合体对A375细胞增殖的影响 按照1.2.1节步骤制备鱼精蛋白-siRNA-1复合体(siRNA1用cy3荧光标记, 浓度为0.347 μ g/μ L), 根据两者质量比不同得到球状和纤维状复合体, 分别加入黑色素瘤细胞A375的培养液, 置于细胞培养箱中8 h后, 在激光共聚焦显微镜下(波长为550 nm)观察细胞.

取对数生长期的黑色素瘤细胞A375, 按5000 Cell/孔接种于96孔培养板内. 根据lipo脂质体转染实验所需siRNA浓度, 实验组每孔加入不同形貌复合体(siRNA为5 pmol), 分为lipoHigh脂质体组(培养液加入lipoHigh脂质体)、 siRNA组(培养液加入lipoHigh脂质体和siRNA1)、 磷脂微囊组(培养液加入磷脂微囊)、 球状复合体组(培养液加入磷脂微囊和球状复合体)、 纤维状复合体组(培养液加入磷脂微囊和纤维状复合体)及空白对照组. 分别转染8 h后更换培养液, 于24和48 h终止培养, 每孔加入5 mg/mL MTT溶液20 μ L, 继续培养4 h, 弃去孔中培养液, 每孔加入150 μ L DMSO, 振荡10 min, 用酶标仪检测各孔光密度(OD)值, 检测波长为490 nm. 根据下式计算细胞增殖率(RGR, %):

RGR=ODexperiment/ODcontrol×100%(1)

首先, 将鱼精蛋白与含有不同碱基序列的siRNA-1和siRNA-2分别以质量比为15∶ 1, 20∶ 1, 25∶ 1, 30∶ 1, 35∶ 1和40∶ 1混合, 并于室温下孵育, 形成的鱼精蛋白-siRNA复合体分别用20%聚丙烯酰胺凝胶电泳解析和银染呈带, 结果如图1(A)和(B)所示. 可见, 随着鱼精蛋白/siRNA质量比的增加, siRNA的条带逐渐变浅. 当鱼精蛋白与siRNA-1或siRNA-2的质量比为20∶ 1时, siRNA条带近乎完全消失, 表明siRNA已经与鱼精蛋白作用完全, 并形成了分子质量非均一的鱼精蛋白-siRNA复合体. 当鱼精蛋白和siRNA-1以20∶ 1的质量比同时增加反应体系中各自分子个数时, 所得鱼精蛋白-siRNA-1复合体的数量增多, 且分子量均增大[图1(C)], 表明较高分子量的鱼精蛋白-siRNA-1复合体形成与反应体系中鱼精蛋白分子和siRNA-1分子的数量呈正相关.

Fig.1

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Fig.1 PAGE analysis on the formations of protamine-siRNA complexes Protamine-siRNA-1 complexes in (A) or protamine-siRNA-2 complexes in (B) were formed by protamine and siRNA by mass ratios of 15∶ 1, 20∶ 1, 25∶ 1, 30∶ 1, 35∶ 1, 40∶ 1, respectively. Lane 1: siRNA-1(A) or siRNA-2(B); lanes 2— 7: protamine-siRNA complexes formed by mass ratios of protamine to siRNA-1(A) or siRNA-2(B) by 15∶ 1, 20∶ 1, 25∶ 1, 30∶ 1, 35∶ 1, 40∶ 1, respectively. Protamine-siRNA-1 complexes formed by a mass ratio of protamine to siRNA-1 by 20∶ 1(C). Lane 1: siRNA-1, lanes 2— 7: protamine-siRNA-1 complexes formed by simultaneously increasing the protamine and siRNA-1 by 2.5, 5.0, 7.5, 10.0, 12.5, 15.0 μ L, respectively.

鉴于siRNA-1和siRNA-2之间并无碱基序列相似性, 因此鱼精蛋白与siRNA分子的结合不表现序列特异性. 基于此, 后续实验选取siRNA-1与鱼精蛋白形成的复合体, 对两者之间的作用方式、 结合位点以及复合体形态进行了研究.

研究表明, Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mn²⁺和Mg²⁺等阳离子均参与RNA的折叠^[27]. 其中, Na⁺和K⁺能通过长程静电力与RNA分子中磷酸-戊糖骨架上的磷酸基作用, Ca²⁺, Mn²⁺和Mg²⁺既可与RNA分子发生长程静电作用, 又可以通过电荷转移和极化等非静电作用方式与RNA在短距离内发生强烈相互作用, 形成稳定复合体. 以Mg²⁺与DNA作用为例, Mg²⁺能与DNA分子中磷酸-戊糖骨架上的磷酸基形成“ 十元环” 结构^[27]. 为了获悉鱼精蛋白与siRNA形成复合体所依赖的作用方式和相互作用位点, 分别利用Na⁺, K⁺, Ca²⁺, Mn²⁺和Mg²⁺等阳离子作为探针, 采取与鱼精蛋白-siRNA复合体共混等方式, 分析了这些离子与鱼精蛋白竞争siRNA的能力.

随着加入的金属阳离子浓度的增加, 鱼精蛋白-siRNA复合体中的鱼精蛋白被阳离子逐渐替换, 形成siRNA-阳离子复合物. 图2(A)和(B)表明, 较低浓度的Na⁺和K⁺基本不影响复合体的稳定性; 但当Na⁺和K⁺浓度分别为15和25 mmol/L时, 开始出现游离siRNA[图2(A)lane 6和图2(B)lane 7]. 此结果表明, Na⁺与siRNA结合的能力大于K⁺与siRNA的结合力. 一价金属阳离子与相同类型siRNA结合的差异, 表明二者的结合并不只依赖简单的静电长程作用. 进一步比较了二价金属阳离子Ca²⁺和Mn²⁺(离子半径Ca²⁺> Mn²⁺)对鱼精蛋白-siRNA复合体中鱼精蛋白的竞争能力. 图2(C)和(D)表明, Ca²⁺和Mn²⁺均对鱼精蛋白-siRNA复合体中鱼精蛋白和siRNA的相互作用产生影响, 表现为 Ca²⁺< Mn²⁺. 与一价金属阳离子Na⁺和K⁺相比, Ca²⁺和Mn²⁺在浓度为10 mmol/L时开始与鱼精蛋白发生明显的作用, 当体系中Ca²⁺和Mn²⁺浓度为10~15 mmol/L时, 2种阳离子各自与鱼精蛋白的竞争作用差别不明显, 但均表现为Ca²⁺< Mn²⁺. 当反应体系中Ca²⁺的浓度增加至25和50 mmol/L时, 鱼精蛋白-siRNA复合体的分子量进一步降低[图2(C) lanes 7和8]; 在同等条件下, Mn²⁺却不再对鱼精蛋白-siRNA复合体的分子量产生明显影响[图2(D) lanes 7和8]. 上述结果表明, 二价阳离子Ca²⁺和Mn²⁺对鱼精蛋白与siRNA之间相互作用也不仅是通过静电力实现的.

Fig.2

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Fig.2PAGE analysis on the effects of different metal ions on the stabilities of protamine-siRNA complexes Protamine-siRNA complexes reacted with different concentrations of NaCl(A), KCl(B), CaCl2(C), MnCl2(D) and MgCl2(E) and formed in the presence of different concentrations of Mg2+ (0, 2.5, 5, 10, 15, 25 and 50 mmol/L)(F). Lane 1: siRNA, lanes 2— 8: protamine-siRNA complexes reacted with different metal ions with a final concentration of 0, 2.5, 5, 10, 15, 25 and 50 mmol/L, respectively.

为了进一步理解Ca²⁺和Mn²⁺作用的差异, 考察了Mg²⁺对鱼精蛋白-siRNA复合体稳定性的影响. Mg²⁺离子半径小、 电荷密度高, 可与DNA分子中磷酸-戊糖骨架上的磷酸基团形成“ 十元环” 结构(Mg²⁺-DNA复合体)^[27]. 鉴于RNA和DNA拥有相似的磷酸-戊糖骨架, 且磷酸基团在DNA和RNA磷酸-戊糖骨架中的理化性质相同, 考察了Mg²⁺对鱼精蛋白-siRNA复合体稳定性的影响.

由图2(E)可知, 当反应体系中含有5 mmol/L Mg²⁺时, 鱼精蛋白与siRNA(质量比20∶ 1)形成复合体的反应明显受到Mg²⁺的影响, 出现了Mg²⁺-siRNA复合体和较低分子量的鱼精蛋白-siRNA复合体[图2(E)lane 4]. 随着反应体系中Mg²⁺浓度的增加, 出现了大量的Mg²⁺-siRNA复合体[图2(E)lanes 5~8], 表明Mg²⁺能抑制鱼精蛋白与siRNA的结合. 为了进一步确定Mg²⁺抑制鱼精蛋白与siRNA结合的反应类型, 尝试向鱼精蛋白-siRNA复合体中加入不同浓度的Mg²⁺[图2(F)]. 结果表明, 5 mmol/L的Mg²⁺可以“ 夺取” 鱼精蛋白-siRNA复合体中的siRNA, 形成Mg²⁺-siRNA复合物[图2(F) lane 4]; 当体系中Mg²⁺浓度小于25 mmol/L时, 鱼精蛋白-siRNA复合体和Mg²⁺-siRNA复合体分布基本达到平衡[图2(F) lanes 5~7]; 但继续增大Mg²⁺浓度至50 mmol/L时, 终产物以Mg²⁺-siRNA复合体为主[图2(F) lane 8]. 这表明Mg²⁺、 鱼精蛋白与siRNA的作用体现浓度依赖竞争. 对比图2可见, 二价阳离子Mg²⁺, Mn²⁺和Ca²⁺与鱼精蛋白-siRNA复合体中的鱼精蛋白“ 争夺” siRNA的能力依次减弱. 基于Mg²⁺与DNA分子可形成稳定“ 十元环” 结构, 推测Mn²⁺, Ca²⁺若与 siRNA形成类似Mg²⁺-siRNA的“ 十元环” 结构, 其能力均弱于Mg²⁺.

TEM结果(图3)表明, 当鱼精蛋白与siRNA质量比分别为20∶ 1和40∶ 1时, 形成了不同形貌(球形和纤维形)的复合体.

Fig.3

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	Fig.3 TEM images of protamine-siRNA complexes formed by protamine and siRNA with the mass ratios of 20∶ 1(A) and 40∶ 1(B)

AFM结果(图4)表明, 鱼精蛋白与siRNA形成的“ 颗粒状” 复合体为鱼精蛋白通过静电作用将siRNA分子压缩形成的环状结构^[8]. 鲑鱼精蛋白具有保守的精氨酸结构域, 在HEPES缓冲液中精氨酸解离带正电荷, siRNA磷酸骨架上的磷酸基团则带有负电荷, 两者通过静电力把siRNA单体“ 压缩” 成环[图4(A)]. 此外, 当鱼精蛋白与siRNA的质量比进一步增加, 则形成纤维状复合体[图4(B)和(C)]. 不同形态的鱼精蛋白-siRNA复合物中鱼精蛋白与siRNA相互作用的示意图见Scheme 1.

Fig.4

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	Fig.4 AFM visualizations of protamine-siRNA complexes with the mass ratios of protamine to siRNA 20∶ 1(A, toroid) and 40∶ 1(B, filamentous) and protamine proteins(white dots) in the filamentous protamine-siRNA complexes(C)

Scheme 1

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	Scheme 1 Schematic illustrations for the interactions between protamine and siRNA in protamine-siRNA complexes of different morphologies

有些鱼精蛋白中含半胱氨酸残基, 易形成二硫键, 本文使用的鲑鱼精蛋白在理论上不含半胱氨酸. 但是, 为了进一步确认所得鱼精蛋白-siRNA纤维复合体不是通过鱼精蛋白形成二硫键而形成, 对纤维状复合体中是否含有二硫键进行了分析. 分别用0, 5, 10, 15, 20和40 mmol/L的β -巯基乙醇对复合体进行还原处理. 电泳结果如图5所示, 可见纤维状鱼精蛋白-siRNA复合体不因巯基乙醇的处理而发生电泳行为的改变.

Fig.5

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	Fig.5 PAGE analysis on the formation of disulfide bonds in the protamine-siRNA complexes Lane 1: siRNA, lanes 2— 7: protamine-siRNA complexes of filament morphologies treated using β -mercaptoethanol with a final concentration of 0, 5, 10, 15, 20 and 40 mmol/L, respectively.

利用纳米粒度仪测试了制备的不同鱼精蛋白-siRNA复合体的粒径, 结果列于表2. 可见, 随着反应体系中鱼精蛋白量的增加, 形成的复合体的粒径也增大, 表明鱼精蛋白与siRNA可依据反应体系中二者分子量不同形成不同类型的复合体.

Table 2

Table 2

Table 2 Particle sizes of the protamine-siRNA complexes Mass ratio of protamine to siRNA d(90)/nm Mass ratio of protamine-siRNA d(90)/nm 15∶ 1 217.5± 6.7 30∶ 1 325.8± 7.6 20∶ 1 220.0± 7.2 35∶ 1 384.2± 6.2 25∶ 1 275.5± 5.0 40∶ 1 405.0± 4.3

Table 2 Particle sizes of the protamine-siRNA complexes

由激光共聚焦显微照片(图6)可见, 颗粒状和纤维状鱼精蛋白-siRNA复合体均能进入黑色素瘤细胞A375内, 且主要分布于细胞质中. 随机选取不同视野进行观察并计算转染效率(荧光细胞数占总细胞数的比例). 经计算得出球状鱼精蛋白-siRNA复合体转染效率约为69%, 纤维状鱼精蛋白-siRNA复合体转染效率约为72%, 后者略高于前者.

Fig.6

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	Fig.6 Phagocytosis of A375 melanoma cells on toroid(A) and fibrous(B) protamine-siRNA complexes under confocal fluorescence microscopy

通过MTT实验评价了2种形貌的鱼精蛋白-siRNA复合体对黑色素瘤细胞A375增殖的影响, 结果表明, siRNA组、 球状复合体组和纤维状复合体组对黑色素瘤细胞A375的增殖均有明显影响, 且随着细胞培养时间的延长, 细胞增殖率降低, 存在显著性差异(见图7). 结果表明, 将2种形貌的鱼精蛋白-siRNA复合体递送入细胞的效率与之后所表现出的药效学作用与Lipo脂质体递送siRNA的效果相当, 而且纤维状鱼精蛋白-siRNA复合体对黑色素瘤细胞A375的增殖抑制效果较球状鱼精蛋白-siRNA复合体更好.

Fig.7

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	Fig.7 Effects of protamine-siRNA complexes on the proliferation of A375 cells a. Control; b. lipoHigh; c. phospholipid vesicles; d. siRNA; e. spherical complexes; f. filamentous complexes.