引用本文
李普, 陈英, 夏榕娇, 郭涛, 张敏, 仕春, 汤旭, 贺鸣, 薛伟. 含喹喔啉杨梅素衍生物的合成及生物活性[J]. 高等学校化学学报, 2019,40(5): 909-917.
LI Pu, CHEN Ying, XIA Rongjiao, GUO Tao, ZHANG Min, JIANG Shichun, ANG Xu, HE Ming, XUE Wei. Synthesis and Biological Activities of Myricetin Derivatives Containing Quinoxaline† [J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2019,40(5): 909-917.
Doi:10.7503/cjcu20180828  
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含喹喔啉杨梅素衍生物的合成及生物活性
李普, 陈英, 夏榕娇, 郭涛, 张敏, 仕春, 汤旭, 贺鸣, 薛伟
绿色农药与农业生物工程国家重点实验室培育基地, 教育部绿色农药与生物工程重点实验室,贵州大学精细化工研究开发中心, 贵阳 550025

联系人简介: 薛 伟, 男, 博士, 教授, 博士生导师, 主要从事新农药创制方面的研究. E-mail: wxue@gzu.edu.cn

收稿日期: 2018-12-10
基金资助: 国家重点研发计划项目(批准号: 2017YFD0200506)、 国家自然科学基金(批准号: 21867003)和贵州省科技计划项目(批准号: 20185781)资助.
摘要

利用活性拼接原理, 将喹喔啉引入到杨梅素结构中, 合成了一系列含喹喔啉基团的杨梅素新型衍生物. 采用浊度法测试了目标化合物的体外抑菌活性, 结果表明, 目标化合物对柑橘溃疡病菌( X. Citri)和水稻白叶枯病菌( X. Oryzae)均表现出较好的抑制活性. 目标化合物对柑橘溃疡病菌的抑制活性(EC50)均优于对照药叶枯唑和噻菌铜(EC50分别为54.85和61.13 μg/mL), 其中化合物4o抑制活性(EC50=11.17 μg/mL)最优; 目标化合物对水稻白叶枯病菌的抑制活性EC50均优于对照药叶枯唑和噻菌铜(EC50分别为148.20和175.47 μg/mL), 其中化合物4f抑制活性(EC50=34.49 μg/mL)最优. 采用半叶枯斑法测试了目标化合物的抗烟草花叶病毒(TMV)活性, 结果表明, 所有目标化合物在浓度为500 mg/L时均有一定的抑制作用.

关键词: 杨梅素; 喹喔啉; 抑菌活性; 抗烟草花叶病毒(TMV)活性
中图分类号:O625.42 文献标志码:A
Synthesis and Biological Activities of Myricetin Derivatives Containing Quinoxaline†
LI Pu, CHEN Ying, XIA Rongjiao, GUO Tao, ZHANG Min, JIANG Shichun, ANG Xu, HE Ming, XUE Wei*
State Key Laboratory Breeding Base of Green Pesticide and Agricultural Bioengineering, ey Laboratory of Green Pesticide and Bioengineering of Ministry of Education, enter for Research and Development of Fine Chemicals,Guizhou University, Guiyang 550025, China
Fund:† Supported by the National Key Research and Development Program of China(No. 2017YFD0200506), the National Natural Science Foundation of China(No. 21867003) and the Science and Technology Plan Project of Guizhou Province, China(No. 20185781)
Abstract

According to the active substructure combination theory, a series of novel myricetin derivatives containing quinoxaline moieties was synthesized by introducing the quinoxaline blocks into the structures of myricetins. The antibacterial activities of the target compounds were evaluated via turbidimeter test in vitro. The preliminary bioassay results indicated that all of the title compounds exhibited certain antibacterial activities in vitro against Xanthomonas axonopodis pv. Citri( X. citri) and Xanthomonas oryzae pv. Oryzae( X. oryzae). The compounds were also tested to evaluate the half maximal effective concentration(EC50) of phytopathogenic bacteria. The results showed that all the X. citri EC50 of the target compounds were superior to those of the control drugs of bismerthiazol and thiodiazole copper(54.85 and 61.13 μg/mL, respectively). Compound 4o(EC50=11.17 μg/mL) exhibited the best activity. All of the X. oryzae EC50 of the target compounds were superior to the control drugs of bismerthiazol and thiodiazole copper(148.20 and 175.47 μg/mL, respectively). Compound 4f(EC50=34.49 μg/mL) exhibited the best activity. The in vivo efficacies against tobacco mosaic virus(TMV) of the target compounds were tested through half-leaf method. The results of bioassay showed that the target compounds exhibited certain anti-TMV activities at the concentration of 500 mg/L.

Keyword: Myricetin; Quinoxaline; Antibacterial activity; Anti-TMV activity

微生物对农作物的产量和质量均会造成影响, 严重威胁人类安全[1]. 在全球农作物种植地区, 柑橘溃疡病(Xanthomonas axonopodis pv. Citri, X. citri)和水稻白叶枯病(Xanthomonas oryzae pv. Oryzae, X. oryzae)十分常见, 导致了农作物严重的经济损失. 对它们的防治措施除了利用品种抗性以外, 在病害发生初期采用杀菌剂进行化学防治是重要的应急措施. 由于杀菌剂长期频繁使用, 目前在田间已经检测到了抗药性菌株[2]. 商品农用杀菌剂如醚菌酯、 吡唑醚菌酯、 嘧菌酯、 氟嘧菌酯、 肟菌酯和啶氧菌酯等在杀菌剂市场占据重要地位, 上述化合物结构中均含有氧醚分子片段. 因此, 利用活性拼接原理设计合成含有氧醚的化合物是本文的研究思路之一. 植物病毒对寄主植物的危害, 素有“ 植物癌症” 之称. 如何控制、 减轻或消灭植物病毒的危害, 已成为当前科研工作者面临的一大问题. 因此, 开发出结构新颖的杀菌剂和抗病毒剂化合物十分重要.

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物, 不仅种类繁多, 而且结构类型复杂多样, 具有抑菌[3]和抗癌[4]等广泛的生物活性. 杨梅素(Myr)是一类从杨梅树皮中分离出来的多羟基黄酮类化合物, 广泛存在于豆科(Leguminosae)、 葡萄科(Vitaceae)、 壳斗科(Fagaceae)、 报春花科(Primulaceae)和菊科(Compositae)等植物中[5]. 现代药理活性研究表明, 杨梅素具有抑菌[6]、 抗病毒[7]、 抗癌[8]、 降血糖[9]、 抗氧化[10]和保护神经[11]等多种药理活性, 显示出丰富的资源优势和潜在的利用价值. 肖维等[12]合成了一系列含酰胺类杨梅素衍生物并测试了其对植物病菌的体外抑制活性, 结果表明, 该类化合物对植物病菌的抑制活性较好. Su等[13]测试了杨梅素、 柚皮素、 桔皮素和L-表儿茶素4种化学物质的体外抗猫杯状病毒(FCV-F9)和抗小鼠诺如病毒(MNV)活性, 结果显示, 杨梅素对上述病毒的抑制活性优于桔皮素和柚皮素.

喹喔啉是一类具有芳香性的苯并吡嗪杂环化合物, 具有广谱的抑菌[14]、 抗炎[15]、 抗病毒[16]和抗癌[17]等生物活性. Khan等[18]以酮、 氨基硫脲和2, 3-二氯喹喔啉为原料合成了含甾体噻唑并喹喔啉衍生物, 活性测试结果表明, 该系列化合物的抑菌活性优于对照药阿莫西林. 李琴[19]合成了一系列含喹喔啉基团的1, 4-戊二烯-3-酮醚类化合物, 并测试了其抗烟草花叶病毒(TMV)活性, 结果表明, 在药剂浓度为500 μ g/mL时, 该系列化合物有较好的生物活性, 部分化合物的抗TMV治疗活性和保护活性优于对照药宁南霉素.

本文采用活性拼接方法, 在杨梅素的3位引入喹喔啉活性基团, 合成了16个含喹喔啉基团的杨梅素衍生物, 并测试目标化合物的抑菌及抗TMV活性, 以期发现具有良好抑菌活性和抗TMV活性的化合物, 为相关工作提供了理论依据.

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

杨梅苷原料购于上海诺特生物科技有限公司; 碘甲烷、 取代喹喔啉以及不同链长的二溴烷烃(碳链中碳的个数分别为3, 4, 5, 6)均购于上海探索平台; 其它试剂均为市售分析纯.

Bruker ASCEND400型核磁共振波谱仪[400 MHz, 四甲基硅烷(TMS)为内标, 瑞士Bruker公司]; JEOL-ECX500型核磁共振波谱仪(500 MHz, TMS为内标, 日本JEOL公司); Thermo Scientic Q Exactive高分辨质谱仪(HRMS, 赛默飞世尔科技有限公司); X-4型数字显微熔点测定仪(北京泰克仪器有限公司); Sartorius电子天平(德国赛多利斯集团); QY-20型三用紫外分析仪(上海市安亭电子仪器厂).

1.2 实验过程

目标化合物4a~4p的合成路线如Scheme 1所示.

Scheme 1 Synthetic routes of target compounds 4a─4p
2a: n=3; 2b: n=4; 2c: n=5; 2d: n=6; 4a: n=3, R=H; 4b: n=3, R=3-CH3; 4c: n=3, R=6-Cl; 4d: n=3, R=3-OH; 4e: n=4, R=H; 4f: n=4, R=3-CH3; 4g: n=4, R=6-Cl; 4h: n=4, R=3-OH; 4i: n=5, R=H; 4j: n=5, R=3-CH3; 4k: n=5, R=6-Cl; 4l: n=5, R=3-OH; 4m: n=6, R=H; 4n: n=6, R=3-CH3; 4o: n=6, R=6-Cl; 4p: n=6, R=3-OH

1.2.1 中间体1的合成 中间体1参考前文[20]方法合成.

1.2.2 中间体2a~2d的合成 在100 mL的单口圆底烧瓶中依次加入中间体1(1.2 g, 3 mmol), K2CO3(1.71 g, 12 mmol)和N, N-二甲基甲酰胺(DMF, 30 mL), 常温下搅拌0.5~1 h后, 加入不同链长的二溴烷烃(12 mmol, n=3, 4, 5, 6), 常温下继续反应12 h, 用薄层色谱法(TLC)监测反应(乙酸乙酯). 反应停止后, 将反应液用水(50 mL)分散, 乙酸乙酯萃取(30 mL× 3), 所得乙酸乙酯层依次用HCl(1 mol/L, 30 mL), 饱和NaHCO3(30 mL)和饱和NaCl水溶液(30 mL)分别洗涤2次后, 合并乙酸乙酯层, 经无水Na2SO4干燥, 减压除去溶剂, 再经柱层析[V(石油醚)∶ V(乙酸乙酯)=2∶ 1]分离提纯, 得到中间体2a2d.

1.2.3 目标化合物4a~4p的合成 在100 mL的单口圆底烧瓶中加入中间体3(1.73 mmol), K2CO3(4.71 mmol)和DMF(30 mL), 常温下搅拌0.5~1 h, 缓慢加入中间体2(1.57 mmol)的DMF(10 mL)溶液, 随后升温至100 ℃并继续反应4~6 h. 用TLC跟踪检测反应(乙酸乙酯), 反应停止后冷却至室温, 将反应液倒入冰水(250 mL)中, 用二氯甲烷萃取(30 mL× 3), 合并有机层, 用饱和NaCl水溶液洗涤(30 mL× 3), 无水Na2SO4干燥, 减压除去溶剂, 得到粗产物, 经柱层析[V(乙酸乙酯)∶ V(甲醇)=15∶ 1~10∶ 1]提纯得到目标化合物4a~4p.

中间体及目标化合物的结构表征谱图(图S1~图S52, 见本文支持信息); 其理化性质、 高分辨质谱及核磁共振波谱数据分别列于表1和表2.

Table 1 Appearance, yields, melting points and HRMS data of compounds 1, 2a— 2d and 4a— 4p
Table 2 1H NMR and 13C NMR data of compounds 2c, 2d and 4a— 4p

1.2.4 目标化合物的抑菌活性测试 采用浊度法[21, 22], 以杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜为对照药剂, 测试了目标化合物在100和50 μ g/mL浓度下对柑橘溃疡病菌和水稻白叶枯病菌的体外抑制活性.

1.2.5 目标化合物的抗烟草花叶病毒(TMV)活性测试 采用半叶枯斑法[23], 以心叶烟为枯斑寄主, 以杨梅素、 宁南霉素和病毒唑为对照药剂, 测试了目标化合物在500 mg/L浓度下对TMV的治疗活性、 保护活性和钝化活性.

2 结果与讨论
2.1 目标化合物的合成及结构表征

在制备目标化合物时, 曾尝试使用K2CO3/CH3COCH3, NaOH/CH3COCH3, K2CO3/CH3CN, NaOH/CH3CN, K2CO3/DMF和NaOH/DMF等体系进行反应, 发现除了K2CO3/DMF体系外, 其它体系反应不完全或副产物较多且后处理困难.

以目标化合物4e为例, 在其 1H NMR谱图中, δ 8.54~7.62处的5个H可归属于喹喔啉上的氢, δ 7.37~6.47处的4个H可归属于杨梅素苯环上的氢, δ 4.45~4.01及δ 1.93~1.85处的8个H可归属于碳链上的亚甲基氢, δ 3.90~3.73处的15个H可归属于杨梅素苯环上5个甲氧基的氢. 在其HRMS谱图中, 目标产物的实测值和理论计算值一致, 误差均≤ 5%, 这进一步证实了目标化合物的结构.

2.2 目标化合物的抑菌活性

目标化合物4a~4p的抑菌活性测试结果(表3)表明, 所有化合物对柑橘溃疡病菌和水稻白叶枯病菌均有一定的抑制活性. 对于柑橘溃疡病菌, 该系列化合物在浓度为100和50 μ g/mL时的抑制率均超过对照药杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜. 对于水稻白叶枯病菌, 该系列化合物在100和50 μ g/mL时的抑制率大多数超过对照药杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜.

Table 3 Antibacterial activities of target compounds 4a— 4p

以杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜作为对照药剂, 测试了部分化合物抑制柑橘溃疡病菌和水稻白叶枯病菌的EC50值, 结果列于表4和表5. 由表4可知, 目标化合物抗柑橘溃疡病菌的EC50值优于对照药杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜. 其中, 化合物4o和4p的EC50值分别为11.17和11.80 μ g/mL, 明显优于对照药杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜(EC50值分别为107.20, 54.85和61.13 μ g/mL). 由表5可知, 所测目标化合物抗水稻白叶枯病菌的EC50值优于对照药杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜. 其中, 化合物4f的EC50值为34.49 μ g/mL, 明显优于对照药杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜(EC50值分别为222.44, 148.20和175.47 μ g/mL).

Table 4 EC50 values of some compounds against X. citri
Table 5 EC50 values of some compounds against X. oryzae

构效关系研究表明, 当碳链数n和取代基R相同时, 目标化合物对柑橘溃疡病菌的抑制效果优于对水稻百叶枯病菌的抑制效果. 对于柑橘溃疡病菌, 当碳链数n=3或4时, 取代基R为3-CH3的化合物的活性优于含其它取代基化合物的活性; 当碳链数n=6且R为6-Cl时, 化合物4o的抑制活性相对较好, 其EC50值为11.17 μ g/mL, 活性明显优于对照药剂叶枯唑(EC50=54.85 μ g/mL). 对于水稻白叶枯病菌, 当碳链数n=4且R为3-CH3时, 化合物4f的抑制活性相对较好, 其EC50值为34.49 μ g/mL, 活性明显优于对照药剂叶枯唑(EC50=148.20 μ g/mL).

2.3 目标化合物的抗TMV活性

目标化合物4a~4p抗TMV活性测试结果(表6)表明, 在浓度为500 mg/L时, 所有化合物均具有一定的抗TMV活性. 治疗活性方面, 化合物4f, 4g, 4m和4o的TMV抑制率分别为50.3%, 51.6%, 51.4%和50.1%, 优于对照药杨梅素和病毒唑(抑制率为31.6%和39.9%), 接近对照药宁南霉素(抑制率为52.7%); 保护活性方面, 化合物4g和4m的TMV抑制率分别为59.8%和62.3%, 优于对照药杨梅素和病毒唑(抑制率为42.1%和51.8%), 接近对照药宁南霉素(抑制率为65.7%); 钝化活性方面, 化合物4e, 4g, 4k, 4m和4p的TMV抑制率分别为75.1%, 77.7%, 73.6%, 78.3%和74.9%, 超过对照药杨梅素和病毒唑(50.9%和73.3%).

Table 6 Antiviral activities of the test compounds against TMV in vivo at 500 mg/L

构效关系研究表明, 当碳链个数n相同时, 化合物活性与取代基R的关系为: n=3, 4, 5时, R为6-Cl的活性最好; n=6时, R为H的活性最好. 当取代基R相同时, 化合物活性与碳链个数n的关系如下: R为H或3-OH时, n=6的活性最好; R为6-Cl或3-CH3时, n=4的活性最好.

3 结 论

以杨梅苷、 碘甲烷、 二溴烷烃和取代喹喔啉为原料, 合成了16个新型含喹喔啉基团的杨梅素衍生物, 并测试了目标化合物的抑菌活性和抗烟草花叶病毒(TMV)活性. 结果表明, 所有化合物对柑橘溃疡病菌和水稻白叶枯病菌均有一定的抑制活性. 所测目标化合物的EC50值均优于对照药杨梅素、 叶枯唑和噻菌铜. 所有化合物均有一定的抗TMV活性, 其中大部分化合物的活性优于杨梅素. 综上, 目标化合物对植物病菌和植物病毒的活性较杨梅素有明显的提高. 本文研究结果有助于杨梅素衍生物作为新型杀菌剂和抗病毒剂的研究与开发.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20180828.

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