引用本文
陈栋栋, 宋文植, 李慧, 何丹, 孙俊奇, 尹万忠. 聚合物复合物层层组装膜的高效负载及大分子和小分子药物的差别性释放[J]. 高等学校化学学报, 2019,40(3): 592-600.
CHEN Dongdong, SONG Wenzhi, LI Hui, HE Dan, SUN Junqi, YIN Wanzhong. Layer-by-layer Assembled Polymeric Complexes Films for High Loading and Differential Release of Macromolecular and Small Molecular Drugs† [J]. Chemical Journal of Chinese Universities, 2019,40(3): 592-600.
Doi:10.7503/cjcu20180408  
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聚合物复合物层层组装膜的高效负载及大分子和小分子药物的差别性释放
陈栋栋2, 宋文植3, 李慧3, 何丹1, 孙俊奇2, 尹万忠1
1. 吉林大学第一临床医院, 长春 130021
2. 吉林大学超分子结构与材料国家重点实验室, 化学学院, 长春 130012
3. 吉林大学中日联谊医院, 长春 130031

联系人简介: 尹万忠, 男, 博士, 副教授, 主要从事纳米材料和高分子材料技术在头颈外科的应用研究. E-mail: yinwz@jlu.edu.cn

收稿日期: 2018-06-04
基金资助: 国家自然科学基金(批准号: 3A413AK53428, 81372900)和吉林省科技厅项目(批准号: 20180414014GH)资助.
摘要

基于聚合物复合物和层层组装技术实现了大分子药物硫酸软骨素和小分子药物头孢曲松钠在聚合物膜中的高效负载以及差别性释放. 壳聚糖(CHI)和大分子药物硫酸软骨素(CSS)通过静电相互作用力复合, 制备了壳聚糖-硫酸软骨素复合物(CHI-CSS). 以CHI-CSS复合物和透明质酸(HA)为构筑基元, 通过层层组装构筑负载有硫酸软骨素的聚合物复合物膜. 利用后扩散的负载方法将小分子药物头孢曲松钠(CTX)负载到聚合物膜中, 从而实现大分子和小分子2种药物在聚合物膜中的负载. 聚合物膜中负载的CTX和CSS在生理条件下具有快慢不同的差别性释放动力学特性, CTX在6 h内快速释放, 而CSS长效缓释长达14 d. 快速释放的抗生素CTX能够有效抑制细菌感染, 而酶降解作用下缓慢释放的CSS可促进伤口愈合, 在包括头颈外科在内的外科术后感染防治领域有良好应用前景.

关键词: 层层组装; 聚合物复合物; 聚合物膜; 药物传递; 差别性释放
中图分类号:O631 文献标志码:A
Layer-by-layer Assembled Polymeric Complexes Films for High Loading and Differential Release of Macromolecular and Small Molecular Drugs†
CHEN Dongdong2, SONG Wenzhi3, LI Hui3, HE Dan1, SUN Junqi2, YIN Wanzhong1,*
1. The First Clinical Hospital, Jilin University, Changchun 130021, China
2. State Key Laboratory of Supramolecular Structure and Materials, College of Chemistry,Jilin University, Changchun 130012, China
3. China-Japan Union Hospital, Jilin University, Changchun 130031, China
Fund:† Supported by the National Natural Science Foundation of China(Nos.3A413AK53428, 81372900) and the Project of Science and Technology Department of Jilin Province, China(No.20180414014GH).
Abstract

The layer-by-Layer(LbL) assembled polymeric complexes films capable of differential release of macromolecular and small molecular drugs were fabricated by utilizing chitosan(CHI) hydrochloride-chondroitin sulfate sodium(CSS) complexes(denoted as CHI-CSS complexes) as building blocks and post-diffusion of ceftriaxone sodium(CTX). The CHI-CSS complexes were prepared by pre-assembled macromolecular drugs CSS with CHI, and then were LbL assembled with hyaluronic acid(HA) to produce CHI-CSS/HA polymeric films. The small molecular drugs CTX were loaded into the CHI-CSS/HA polymeric films through a postdiffusion process. The as-prepared CHI-CSS/HA polymeric films possess high loading capacity because of the high encapsulation amount of CSS in CHI-CSS complexes and plenty of electrostatic binding sites for CTX provided by film component CHI. CTX can be quickly released from the polymeric films because of the brea-kage of its electrostatic interaction with film component CHI. Meanwhile, the CSS can be released in sustained manner by enzymatic degradation of the films. The synergetic therapeutic effects can be achieved by fast release of antibiotic drug CTX to effectively eliminate bacteria and by sustained release of CSS to promote wound healing. The present work provides a facile way to fabricate polymeric films for high loading and diffe-rential release of multiple therapeutic agents.

Keyword: Layer-by-Layer(LbL) assembly; Polymeric complex; Polymeric film; Drug delivery; Differential release

手术术后的感染防治是外科手术治疗成功的关键环节之一, 除了传统的无菌操作和预防性应用抗生素, 人们开发出越来越多的新型材料, 其中可控释放多药物分子及微纳尺度的局部药物控释载体近年来得到迅速发展. 这类药物控释载体可负载不同药效的药物分子, 在病变部位智能响应释放药物, 可显著提高药物利用率并降低药物的毒副作用, 因此已经成为生物医用材料领域的研究热点[1, 2, 3, 4, 5, 6]. 目前, 人们已经开发出了多种可控释放多药物的载体材料, 如水凝胶[7, 8, 9, 10]、 微/纳胶囊[11, 12, 13, 14]、 聚合物胶束[15, 16]、 纳米粒子[17, 18, 19]、 脂质体[20, 21]及层层组装聚合物膜[22, 23]等. 相较于其它载体材料, 层层组装聚合物膜材料具有载药方法多样[24, 25]、 易于实现智能响应[26, 27]、 涂覆密度高[28, 29]、 可直接涂覆在病变部位[30, 31]或医用材料表面[32, 33, 34]等特点, 受到人们的广泛关注. 根据药物的分子结构特点, 通过层层组装聚合物膜负载方法的合理选择, 已经实现了多种小分子药物及蛋白类药物等不同性质药物分子在层层组装聚合物膜中的负载以及可控释放[31, 35~37]. 我们[36]曾报道了通过大分子前体药物作为层层组装构筑基元和后扩散的负载方法, 制备了可以负载并差别性释放2种抗癌小分子药物的聚合物膜. 然而, 实现大分子药物和小分子药物在层层组装聚合物膜中的高效负载以及智能可控释放仍面临挑战.

聚合物复合物是一种基于分子间弱相互作用力而形成的超分子聚集体[38, 39, 40]. 聚合物复合物可以通过聚合物和不同种类的客体分子进行复合, 因而其组分多样、 结构丰富且易于调控. 以聚合物复合物为层层组装构筑基元制备的聚合物膜, 不仅可以负载大量的客体分子[40], 而且其膜结构可以进行调控[38]. 因此, 聚合物复合物为可负载多种药物分子的层层组装聚合物膜的设计开发提供了一种有效的途径. 本文通过大分子药物硫酸软骨素(CSS)与壳聚糖(CHI)复合制备CHI-CSS复合物, 以CHI-CSS复合物为构筑基元实现了CSS在聚合物膜中的高量负载. CHI-CSS复合物中CHI为小分子药物头孢曲松钠(CTX)提供了丰富的静电结合位点, 实现了CTX在聚合物膜中的高效负载. 研究结果表明, 负载的CTX和CSS具有快慢不同的释放行为. 快速释放的CTX可以有效抑制细菌感染, 而缓释的CSS能够促进伤口的快速愈合.

1 实验部分
1.1 试剂与仪器

医用级壳聚糖盐酸盐(CHI, Mn≈ 300000)购于浙江澳兴生物科技有限公司; 硫酸软骨素(CSS, Mw≈ 100000)购于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司; 医用级透明质酸钠(HA, Mw≈ 1630000)和聚乙烯基亚胺(PEI, Mw≈ 25000)均购于Sigma-Aldrich公司; 溶菌酶购于北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司; 头孢曲松钠(CTX)购于上海新亚药业有限公司. 实验中使用的水均为去离子水(18.2 MΩ ).

QCM-Z500型石英晶体微天平(QCM), KSV公司, 基片为双面镀银的QCM石英晶振片(F0=9 MHz). 聚合物膜的厚度利用Dektak 150探针式表面轮廓仪测定. Nanoscope Ⅳ 型原子力显微镜(AFM), 布鲁克公司. XL30 ESEMFEG场发射扫描电子显微镜(SEM), 飞利浦公司, 样品表面经过喷金处理. Shimadzu UV-2550 spectrophotometer紫外可见吸收光谱仪, 岛津公司. Agilent 1200型高效液相色谱仪, 安捷伦公司. 数码照片由Canon Power Shot S3相机拍摄.

1.2 实验过程

1.2.1 CHI-CSS复合物的制备 CHI-CSS复合物的制备过程如Scheme 1(Ⅰ )所示. 首先配制1 mg/mL CHI水溶液以及0.71 mg/mL CSS水溶液, 然后在搅拌条件下将20 mL CHI溶液一次性倒入20 mL CSS溶液中, 带有正电荷的CHI和带有负电荷的CSS通过静电相互作用形成CHI-CSS聚合物复合物. CHI-CSS复合物中CHI与CSS的摩尔比为4∶ 1, 复合物溶液中CHI的浓度为1 mg/mL.

Scheme 1 Schematic illustration of the formation of CHI-CSS polyelectrolyte complexes(Ⅰ ), and the layer-by-layer assembly process for the fabrication of CHI-CSS/HA polymeric films(Ⅱ )

1.2.2 层层组装CHI-CSS/HA聚合物膜的制备 将镀银的石英晶振片分别在乙醇和水中超声处理5 min, 然后在乙醇、 水和KOH混合溶液(质量比39∶ 60∶ 1)中浸泡20 min, 用去离子水冲洗、 氮气吹干后待用. 硅基底依次用甲苯、 丙酮、 乙醇和去离子水分别超声处理5 min, 而后将基底放入体积比为7∶ 3的98%浓硫酸和30%双氧水的混合溶液中加热至无气泡冒出, 用去离子水洗净, 氮气吹干后待用. CHI-CSS复合物溶液用0.1 mol/L NaOH调pH=6, HA溶液用0.1 mol/L HCl调pH=4. CHI-CSS/HA聚合物膜的组装过程如Scheme 1(Ⅱ )所示. 首先, 将石英晶振片或硅基底浸泡在CHI-CSS复合物溶液中10 min, 用pH=6的去离子水冲洗后氮气吹干, 形成CHI-CSS沉积层; 将基底浸泡在HA溶液中10 min, 用pH=4的去离子水冲洗后氮气吹干, 形成HA沉积层. 重复此过程, 便可制备(CHI-CSS/HA)× n聚合物膜, n代表聚合物复合物膜的组装周期数.

在手术缝合线和医用绷带表面沉积CHI-CSS/HA聚合物膜: 将手术缝合线和医用绷带用大量去离子水洗净并干燥, 在其表面首先组装1个周期的枝化聚乙烯基亚胺/透明质酸, 使其表面沉积有利于CHI-CSS/HA聚合物膜组装的底膜. 然后采用CHI-CSS/HA聚合物膜组装步骤, 重复组装13个周期后, 便可在手术缝合线和医用绷带表面构筑(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜.

1.2.3 药物分子的负载及释放 大分子药物CSS通过CHI-CSS复合物层层组装到聚合物膜中. 小分子抗生素药物CTX通过后扩散的方法负载到CHI-CSS/HA聚合物复合物膜中. 将CHI-CSS/HA聚合物复合物膜浸泡在CTX(35 mmol/L, pH=5)的水溶液中1 h便可以实现CTX分子在CHI-CSS/HA聚合物复合物膜中的饱和负载.

将负载有CSS和CTX的CHI-CSS/HA聚合物膜浸泡在溶有2 mg/mL溶菌酶的磷酸盐(PBS, 0.01 mol/L, pH=7.4)缓冲溶液中, 在37 ℃恒温条件下进行药物的释放. 在特定的时间点, 更换新的缓冲溶液. 利用紫外可见光谱对小分子药物CTX的释放动力学进行检测并依据CTX的浓度标准曲线对药物分子的释放量进行定量分析. 利用高效液相色谱对大分子药物CSS的释放动力学进行检测并依据CSS的浓度标准曲线对药物分子的释放量进行定量分析.

1.2.4 CTX抗菌性能测试 选用大肠杆菌Escherichia coli DH5 α (E. coli)和枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis(B. subtils)分别作为革兰氏阴性及革兰氏阳性菌的代表菌种, 利用Kirby-Bauer法测试膜中释放的CTX的抗菌性能[41]. 将一定数量的菌种置于37 ℃的培养液中(培养液主要成分为100 mg胰蛋白胨、 50 mg酵母提取物、 100 mg氯化钠及10 mL pH=7.0的灭菌去离子水)摇床振荡培养12 h后取200 μ L E. coli和B. subtils菌液均匀涂沫在固态琼脂培养基(即在培养基中加入质量分数为1.5%的琼脂)表面. 将空白硅基片、 未负载CTX的CHI-CSS/HA聚合物膜样品和负载CTX的CHI-CSS/HA聚合物膜样品放置在涂抹有菌种的固态培养基表面, 在37 ℃恒温条件下静置培养24 h, 通过查验抑菌环大小来评价聚合物膜的抑菌效果. 此外, 采用抑菌曲线对膜中释放的CTX在24 h内的抑菌效果进行量化测试. 同样取一定数量的菌种置于37 ℃的培养液中摇床振荡培养12 h, 将已负载CTX聚合物膜样品和空白硅基底(对比样品)放入细菌培养液中, 摇床振荡共培养, 在特定的时间点测定菌液在600 nm处的吸收值(OD600), 由于菌液的OD600值可以间接反映菌液中细菌的相对数量, 因此可以在各个时间点测得OD600吸收值并绘制细菌生长曲线, 以此量化评价膜中释放的CTX的抑菌效果.

1.2.5 CSS生物活性测试 将小鼠成纤维细胞(L929细胞)及体外“ 伤口” 模型用于CSS生物活性测试[42]. 小鼠成纤维细胞(L929细胞)接种于6孔板中, 细胞密度均为1× 104 Cell/孔. 细胞采用Dulbecco’ s modified eagle medium(DMEM)培养液(培养液中含体积分数10%胎牛血清(FBS)、 100 Unit/mL青霉素和100 μ g/mL链霉素), 在37 ℃恒温, 5%CO2孵箱中培养一定时间至细胞均匀覆盖整个板面(表面覆盖率> 90%). 用100 μ L移液枪头划开一条宽约400 μ m的“ 伤口” (伤口模型), 在每孔加入20 μ L待检测溶液后, 在37 ℃恒温下继续培养48 h, 通过显微镜考察“ 伤口” 愈合程度, 表征CSS的生物活性. 以PBS缓冲液、 CSS溶液和聚合物膜释放液(CSS完全释放的溶液)作为待测样品.

2 结果与讨论
2.1 CHI-CSS复合物的制备

带正电荷的CHI和带负电荷的CSS基于静电相互作用以4∶ 1的单体摩尔比复合形成CHI-CSS聚合物复合物[Scheme 1(Ⅰ )]. 制备的CHI-CSS复合物溶液是分散均一的胶体溶液, 具有良好的稳定性, 在室温下放置7 d状态并未发生变化. 利用动态光散射(DLS)研究CHI-CSS复合物的尺寸和表面ζ 电势, 结果如图1所示. 在pH=6时, CHI-CSS复合物的平均流体力学直径为369 nm. CHI-CSS复合物中过量的CHI, 使其表面带正电荷, 表面电势为(34.7± 1.5) mV. 调节pH=5时, CHI-CSS复合物的尺寸没有发生变化, 表面电势升高为(43.1± 3.4) mV. 对比CHI-CSS复合物在不同pH条件下的尺寸和电势, 推断 CHI-CSS复合物为具有核壳结构的胶体粒子, 内部是由聚阳、 阴离子复合形成的内核, 外层是过量的CHI构成的亲水的外壳层[38, 39]. 带正电荷的亲水性壳层使复合物在水溶液中能够稳定均匀地分散. 当pH降低时, 复合物的尺寸并未发生变化, 仅仅是由于壳层氨基质子化程度的增加而引起表面ζ 电势的增大.

Fig.1 Hydrodynamic diameter distribution curve of the aqueous CHI-CSS complex dispersion at pH=6.0
Inset is the photograph of the aqueous CHI-CSS complex dispersion.

2.2 层层组装CHI-CSS/HA聚合物膜的制备

CHI-CSS复合物表面带的正电荷可以和带负电荷的HA通过静电相互作用力层层组装构筑CHI-CSS/HA聚合物复合物多层膜[Scheme 1(Ⅱ )]. 利用石英微重量天平(QCM)对CHI-CSS/HA聚合物膜的组装过程进行检测. 如图2(A)所示, 石英晶振片的振荡频率随着CHI-CSS/HA膜组装周期数的增加而逐渐降低, 说明CHI-CSS复合物和HA组装形成了CHI-CSS/HA聚合物膜. 不同组装周期数的CHI-CSS/HA聚合物膜的厚度利用表面轮廓仪进行测量, 其厚度变化趋势和QCM结果相类似. 在开始的10个周期内, 膜厚度呈现非线性的快速增长, 3个周期膜的厚度为(45.1± 5.1) nm, 10个周期时膜厚迅速增加至(665.9± 5.7) nm. 在10个周期以后膜厚度的变化转变为线性快速增加, 30个周期的膜厚度达到(4614.8± 98.6) nm[图2(B)]. 利用扫描电子显微镜(SEM)图像对(CHI-CSS/HA)× 13膜结构及表面形貌进行了表征. 可见(CHI-CSS/HA)× 13膜的表面分布着许多微米尺度的岛状结构[图2(C)], 这是由于具有一定刚性的CHI-CSS复合物在与HA组装过程中CHI-CSS复合物粒子的堆砌而形成粗糙的表面形貌. 由剖面SEM图测得(CHI-CSS/HA)× 13膜的厚度为(1092.9± 11.3) nm[图2(D)], 这与表面轮廓仪所得结构相符. 为了探究CHI-CSS/HA 聚合物膜快速组装的机理, 利用原子力显微镜(AFM)对不同组装周期数的CHI-CSS/HA膜的表面形貌进行了表征. 测试得到的3, 5, 7, 10, 13, 15个组装周期的CHI-CSS/HA膜的表面均方根粗糙度分别为24.9, 35.9, 79.7, 114.1, 135.3, 151.6 nm(图S1, 见本文支持信息). 结果表明CHI-CSS/HA膜的表面粗糙度随着组装周期数的增加而增加, 而膜表面粗糙度的增加使得膜表面积增加, 增加的膜表面积使得越来越多的成膜物质组装在膜的表面, 从而导致CHI-CSS/HA聚合物膜非线性快速生长的组装行为[43].

Fig.2 Typical QCM frequency decreases for the alternate deposition of CHI-CSS complexes(■) and HA(●)(A), thickness of CHI-CSS/HA films as a function of the number of deposition cycles(B) and top view(C) and cross-sectional(D) SEM images of (CHI-CSS/HA)× 13 films

2.3 CTX和CSS的负载及释放

大分子药物CSS通过 CHI-CSS复合物作为层层组装构筑基元实现了在CHI-CSS/HA聚合物膜中的负载. 小分子药物CTX通过后扩散的负载方法, 将组装有CHI-CSS/HA聚合物膜的基底浸泡在CTX的溶液中1 h便可实现CTX在聚合物膜中的快速饱和负载. CTX在膜中的负载得益于CHI-CSS/HA疏松的内部结构以及膜组分CHI上季胺基团为CTX提供了丰富的静电结合位点. 虽然CTX也可以基于静电相互作用通过与CHI复合, 而后组装负载到聚合物膜中, 然而在组装过程中, 由于组装溶液pH值的不同会影响CTX与CHI之间的静电相互作用, 因而极有可能造成CTX在组装过程中无法稳定地包覆在聚合物膜中而释放出来[44], 而通过后扩散一步法可以在聚合膜中稳定且高量地负载CTX. 此外, 后扩散负载CTX利于实现CTX的快速释放, 可使得CTX在伤口部位短时间内达到有效浓度, 起到抗菌效果. 因此, 在实验中CTX利用后扩散方法进行负载.

选用(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜作为研究对象, 采用含有2 mg/mL溶菌酶的PBS缓冲液为含有生物酶的生理液, 考察37 ℃条件下小分子药物CTX和大分子药物CSS的释放动力学特性. CTX的释放通过紫外可见光谱进行检测[图S2(A), 见本文支持信息]. CTX表现出快速释放的行为, 在最初的1 h内, 约95%的CTX从膜中快速释放出来, CTX在6 h内完全释放[图3(A)]. 释放液中的无机离子破坏了CTX与膜组分CHI之间的静电相互作用力以及CHI-CSS/HA聚合物膜疏松的膜结构使得CTX快速释放出来[32, 36]. CTX在(CHI-CSS/HA)× 13膜中的负载量达到(44.2± 2.2) μ g/cm2. CTX在膜中的高负载量得益于膜中大量的CHI为其提供了丰富的结合位点. CSS的释放通过高效液相色谱进行检测[图S2(B), 见本文支持信息]. 大分子药物CSS表现出缓慢的释放行为, 在最初的2 d内, 约有55%的CSS从膜中释放出来, 随后CSS的释放趋于缓慢, 整个释放过程可持续长达14 d[图3(B)]. CSS的缓慢释放源于释放液中溶菌酶对膜组分CHI的缓慢降解破坏了CHI-CSS复合物结构[45]. CSS在(CHI-CSS/HA)× 13膜中的负载量高达(206.2± 23.3) μ g/cm2. 这是由于CHI-CSS复合物可以复合大量的CSS, 并通过组装负载到聚合物膜中. 伤口的完全愈合一般需要7 d以上的时间, 而CSS的高量负载以及长效缓释将有效地促进伤口的愈合. 因此, 通过聚合物复合物组分的选择以及聚合物复合物层层组装膜结构的调控, 结合聚合物膜中药物分子多样的释放方式, 实现了大分子药物CSS和小分子药物CTX在聚合物膜中的高效负载以及差别性释放. 快速释放的抗生素药物CTX可以在伤口位置迅速达到有效药物浓度, 有效抑制细菌感染. 而高量负载以及缓慢释放的CSS可以有效地促进伤口的愈合, 从而实现2种性质不同、 药效不同的CSS和CTX在伤口愈合方面达到良好的治疗效果.

Fig.3 Time-depended release profile of CTX(A) and CSS(B) from (CHI-CSS/HA)× 13 films in PBS(0.01 mol/L) containing lysozyme(2 mg/mL) at pH=7.4 and 37 ℃

2.4 CTX和CSS抗菌活性及促伤口愈合效果

CTX是头孢类第三代广谱抗生素, 对革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌均具有显著的抑菌作用. 选用大肠杆菌和芽孢枯草杆菌分别作为革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的代表菌种. 利用Kirby-Bauer法对(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜释放的CTX的抗菌效果进行了测试, 结果如图4(A)和(B)所示.

Fig.4 Inhibition of E. coli(A, C) and B. subtilis(B, D) growth by release of CTX from (CHI-CSS/HA)× 13 films loaded with CTX
Agar plates of E. coli.(A) and B. subtilis(B) treated with the control sample(bare silicon substrate) and (CHI-CSS/HA)× 13 films with and without CTX. The growth curves of E. coli(C) and B. coli(D) incubated for 24 h with the control sample(bare silicon substrate) and (CHI-CSS/HA)× 13 films with CTX.

对于阴性菌E. coli和阳性菌B. Subtilis, 空白硅基底和未负载CTX的CHI-CSS/HA聚合物膜样品均没有抑菌环出现, 表明这些样品均不具有抗菌效果. 而不论对于阴性菌E. coli还是阳性菌B. Subtilis, 负载CTX的CHI-CSS/HA聚合物膜样品周围均出现了明显的抑菌环, 显示出其广谱抗菌效果. 这是因为CHI-CSS/HA聚合物膜中负载的CTX可以快速释放出来, 并且很好地保持了CTX的抗菌活性. 为了验证在实际应用中聚合物膜快速释放的CTX能否在伤口处最初24 h内依然保持其良好的抑菌效果, 我们将负载CTX的聚合物膜和细菌共培养24 h, 并测量细菌的生长曲线, 对其抑菌效果进行量化测试. 以空白硅基底作为对照样品, 阴性菌E. coli和阳性菌B. Subtilis的生长曲线分别如图4(C)和(D)所示.

经过24 h共培养后, 空白对照样品共培养的阴性菌和阳性菌的数量在24 h内快速增加. 而负载CTX的聚合物样品对应的阴性菌和阳性菌数量在24 h内均未出现明显增加, 这一结果说明聚合物膜中快速释放CTX在24内仍保持其抑菌活性, 进一步证明负载CTX的聚合物膜24 h内可在伤口处保持其高效的抗菌能力.

大分子药物硫酸软骨素CSS是广泛存在于细胞外基质中的一类糖胺聚糖, 由于其具有生物活性, 因而在临床上常被用于治疗心血管以及关节疾病. 研究表明, 硫酸软骨素可以促进成纤维细胞的迁移, 从而加速伤口的愈合[42, 46, 47]. 通过L929成纤维细胞的“ 伤口” 模型对(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜释放的CSS的促伤口愈合效果进行测试, 即L929细胞迁移到伤口位置(无细胞区)实现“ 伤口” 的愈合过程. 以加入同等体积的PBS 缓冲溶液为阴性对照样, 加入同等质量CSS溶液为阳性对照样. 测试样品对伤口修复情况以及伤口修复的统计数据如图5所示.

经过48 h培养后, (CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜释放的CSS可有效促进L929细胞在伤口位置的迁移[图5(A)], 表明释放的CSS保持了其生物活性, 统计结果表明, 伤口愈合率达到82.9%[图5(D)], 这与阳性对照样(CSS)的伤口愈合率(82.2%)基本一致[图5(B)和(D)]. 而阴性对照样(PBS溶液)并未出现明显的细胞迁移行为, 伤口仅达到47%的愈合[图5(C)和(D)]. 这些结果表明聚合物膜内释放出来的CSS很好地保持了其生物活性, 能够促进“ 伤口” 的愈合. 因此, 层层组装CHI-CSS/HA聚合物膜实现了大分子药物CSS和小分子抗生素CTX的高量负载, 并且可以差别性释放CTX和CSS, 同时起到抗菌及加速伤口愈合的作用.

Fig.5 Bioactivity of released CSS from (CHI-CSS/HA)× 13 films on wound healing in vitro
The mouse fibroblast L929 cells with wound gap incubated for 48 h with growth medium containing released CSS(A), free CSS(B) and blank PBS(C). (D) Statistical analysis of wound healing for L929 cells incubated with blank PBS(negative control), free CSS(positive control) and released CSS.

2.5 CHI-CSS/HA膜在手术缝合线和医用绷带表面的构筑

为了进一步验证CHI-CSS/HA聚合物膜的实用性, 研究了(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜在手术缝合线和医用绷带表面的组装沉积. 在组装CHI-CSS/HA聚合物膜之前手术缝合线和医用绷带表面首先组装1个周期的枝化聚乙烯基亚胺/透明质酸, 使其表面沉积有利于CHI-CSS/HA聚合物膜组装的底膜. 利用SEM对手术缝合线和医用绷带在组装(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜前后的表面形貌进行了表征. 如图6所示, 手术缝合线由许多单股蚕丝线相互缠绕构成, 蚕丝线表面在沉积(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜之前表面并不平整, 而组装(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜后, 表面可以清晰地观察到连续的聚合物膜, 且表面变得平整光滑. 医用绷带的表面在沉积(CHI-CSS/HA)× 13聚合物膜前后也表现出相似的现象. 结果说明, CHI-CSS/HA聚合物膜可方便地在手术缝合线和医用绷带表面沉积, 具有良好的实际应用前景.

Fig.6 SEM images of surgical sutures(A, C) and bandages(B, D) before(A, B) and after(C, D) depositing with (CHI-CSS/HA)× 13 films

3 结 论

基于CHI-CSS复合物的层层组装以及后扩散负载CTX, 实现了大分子药物CSS和小分子药物CTX在层层组装聚合物膜中的高效负载和差别性释放. CHI-CSS复合物中大量包覆的CSS以及CHI组分为CTX提供了丰富的静电结合位点, 实现了CSS和CTX 2种药物分子在聚合物膜中高量负载. 聚合物膜负载的CTX和CSS表现出快慢不同的释放行为. 抗菌和细胞实验结果表明, 快速释放的抗生素药物CTX具有广谱的抗菌效果, 可有效避免伤口的感染, 缓慢释放的大分子药物CSS可以促进细胞的迁移加速伤口的愈合, 从而实现2种药物分子协同治疗的效果. 此类聚合物膜可在手术缝合线和医用绷带表面组装沉积, 在包括头颈外科在内的外科术后感染防治中展示出良好的应用前景. 也为可高效负载及差别性释放大分子和小分子药物聚合物膜的设计开发提供了新的研究思路.

支持信息见http://www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20180408.

参考文献
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